试验二食品中总氮的测定

实验二食品中总氮的测定（二）原理有机物中的氮在强热和浓HSO作用下，生成（NH）SO，在凯氏定氮器中与碱作用，24424通过蒸馏释放出氨，用硼酸将氨吸收后以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，计算蛋白质含量。（三）仪器与试剂定氮蒸馏装置（如图3-1），微量滴定管。2．硫酸铜，硫酸钾，硫酸。2%硼酸溶液称取20g硼酸溶解在少量蒸馏水中，再稀释至1000ml。混合指示剂1份0.1％甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。40%氢氧化钠溶液40g氢氧化钠溶解于蒸馏水中，再稀释至100ml。0.05mol／L盐酸标准溶液（四）操作步骤样品处理精密称取0.2〜2.0g固体样品或2〜5g半固体样品或吸取10〜20ml液体样品（约相当氮30〜40mg）,移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加人0.2g硫酸铜、3g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20ml水。放冷，移人100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容置瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。按图3.1装好定氮装量，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。向接收瓶内加入10m12%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插人液面下，吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，以10ml水洗涤小玻杯并使其流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10m140%氢氧化钠溶液倒人小玻杯，提起玻塞使其缓缓流人反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。%3-1微■凯氏定氮蒸%3-1微■凯氏定氮蒸18装・1—电炉；2—水蒸气发生器;3—螺旋夹$4—小玻杯X="W—%>X竺X6°14xFX100式中：X—样品中蛋白质的含量，％V.—样品消耗盐酸标准液的体积，mlV2—试剂空白消耗盐酸标准液的体积，mlAf—盐酸标准溶液的摩尔浓度，mol/L袒一样品的质量（体积），牡mJF—氮换算为蛋白质的系数0.014—lmol/L盐酸标准溶液1ml相当于氮克数蛋白质中的氮含量一般为15%〜17.6%,按16%计算乘以6.25即为蛋白质含量，乳制品的蛋白质换算系数为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71,肉与肉制品为6.25,大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83,芝麻、向日葵为5.30。（五）注意事项消化要在通风橱内进行,消化时要把附在管壁上的食物用少量硫酸冲下,使消化完全。蒸馏时要随时注意防止蒸馏器漏水漏气等现象的发生。蒸馏时向反应室内加NaOH动作要快，玻璃塞塞严并立即用少量水密封，以免氨的逸出。3．严禁酸碱污染硼酸吸收液及冲洗用水。测定前应先用标准（NH4）SO做氮回收率的测定，借以验证所用仪器，试剂及操作24等条件的可靠性。氮回收率应在95%与105%之间。总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法GB11894—89Waterquality-Determinatlonoftotalnitrogen-Alkalinepotassiumpersulfatedigestion-UVspectrophotometricmcthod主题内容与适用范围主题内容本标准规定了用碱性过硫酸钾在120〜124°C消解、紫外分光光度测定水中总氮的方法。适用范围本标准适用于地面水、地下水的测定。本法可测定水中亚硝酸盐氮、硝酸盐氨、无机铵盐、溶解态氨及大部分有机含氮化合物中氮的总和。氮的最低检出浓度为0.050mg/L,测定上限为4mg/L。本方法的摩尔吸光系数为1.47X103L・mol—l・cm—1。测定中干扰物主要是碘离子与溴离子，碘离子相对于总氮含量的2.2倍以上，溴离子相对于总氮含量的3.4倍以上有干扰。某些有机物在本法规定的测定条件下不能完全转化为硝酸盐时对测定有影响。定义2.1可滤性总氮：指水中可溶性及含可滤性固体(小于0.45“m颗粒物)的含氮量。总氮：指可溶性及悬浮颗粒中的含氮量。原理在60°C以上水溶液中，过硫酸钾可分解产生硫酸氢钾和原子态氧，硫酸氢钾在溶液中离解而产生氢离子，故在氢氧化钠的碱性介质中可促使分解过程趋于完全。分解出的原子态氧在120〜124C条件下，可使水样中含氯化合物的氮元素转化为硝酸盐。并且在此过程中有机物同时被氧化分解。可用紫外分光光度法于波长220和275nm处，分别测出吸光度A220及A275按式(1)求出校正吸光度A：A=A220—2A275 (1)按A的值查校准曲线并计算总氮(以NO3－N计)含量。试剂和材料除非(4.1)另有说明外，分析时均使用符合国家标准或专业标准的分析纯试剂。水，无氨。按下述方法之一制备；离子交换法：将蒸馏水通过一个强酸型阳离子交换树脂(氢型)柱，流出液收集在带有密封玻璃盖的玻璃瓶中。4.1.2蒸馏法：在1000mL蒸馏水中，加入0.10mL硫酸(p=1.84g/mL)。并在全玻璃蒸馏器中重蒸馏，弃去前50mL馏出液，然后将馏出液收集在带有玻璃塞的玻璃瓶中。4.2氢氧化钠溶液，200g/L：称取20m氢氧化钠(NaOH),溶于水(3.1)中，稀释至100mL。4.3氢氧化钠溶液，20g/L：将(4.2)溶液稀释10倍而得。4.4碱性过硫酸钾溶液：称取40g过硫酸钾(K2S2OB)，另称取15g氢氧化钠(NaOH)，溶于水(4.1)中，稀释至1000mL，溶液存放在聚乙烯瓶内，最长可贮存一周。盐酸溶液，1＋9。硝酸钾标准溶液。4.6.1硝酸钾标准贮备液，CN=100mg/L:硝酸钾(KNO3)在105〜110C烘箱中干燥3h，在干燥器中冷却后，称取0.7218g，溶于水(4.1)中，移至1000mL容量瓶中，用水(4.1)稀释至标线在0〜10C暗处保存，或加入1〜2mL三氯甲烷保存，可稳定6个月。4.6.2硝酸钾标准使用液，CN=10mg/L：将贮备液用水(4.1)稀释10倍而得。使用时配制。硫酸溶液，1＋35。仪器和设备常用实验室仪器和下列仪器。5.2紫外分光光度计及10mm石英比色皿。5.3医用手提式蒸气灭菌器或家用压力锅(压力为1.1〜1.4kg/cm2)，锅内温度相当于120〜124C。5.4具玻璃磨口塞比色管，25mL。所用玻璃器皿可以用盐酸(1＋9)或硫酸(1＋35)浸泡，清洗后再用水(4.1)冲洗数次。样品采样在水样采集后立即放入冰箱中或低于4C的条件本保存，但不得超过24h。水作放置时间较长时，可在1000mL水样中加入约0.5mL硫酸(p=1.84g/mL)，酸化到pH小于2，并尽快测定。样品可贮存在玻璃瓶中。试样的制备取实验室样品(6.1)用氢氧化钠溶液(4.3)或硫酸溶液(4.7)调节pH至5〜9从而制得试样。如果试样中不含悬浮物按(7.1.2)步骤测定，试样中含悬浮物则按(7.1.3)步骤测定。分析步骤测定7.1.1用无分度吸管取lO.OOmL试样(CN超过100pg时，可减少取作量并加水(4.1)稀释至10mL)置于比色管中。试样不含悬浮物时，按下述步骤进行。加入5mL碱性过硫酸钾溶液(4.4),塞紧磨口塞用布及绳等方法扎紧瓶塞，以防弹出。将比色管置于医用手提蒸气灭菌器中，加热，使压力表指针到1.1〜1.4kg/cm2，此时温度达120〜124°C后开始计时。或将比色管置于家用压力锅中，加热至顶压阀吹气时开始计时。保持此温度加热半小时。冷却、开阀放气，移去外盖，取出比色管井冷至室温。加盐酸(1+9)1mL,用无氨水稀释至25mL标线，混匀。移取部分溶液至10mm，石英比色皿中，在紫外分光光度计上，以无氨水作参比，分别在波长为220与275nm处测定吸光度，并用式(1)计算出校正吸光度A。7.1.3试样含悬浮物时，先按上述7.1.2中a至d步骤进行，然后待澄清后移取上清液到石英比色皿中。再按上述7.1.2中e步骤继续进行测定。空白试验空白试验除以10mL水(4.1)代替试料外，采用与测定完全相同的试剂、用量和分析步骤进行平行操作。注：当测定在接近检测限时，必须控制空白试验的吸光度Ab不超过0.03，超过此值，要检查所用水、试剂、器皿和家用压力锅或医用手提灭菌器的压力。校准校准系列的制备：用分度吸管向一组(10支)比色管(5.4)中，分别加入硝酸盐氮标准使用溶液(4.6.2)0.0,0.10，0.30，0.50，0.70，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00mL。加水(4.1)稀释至10.00mL。按7.1.2中a至e步骤进行测定。校准曲线的绘制：零浓度(空白)溶液和其他硝酸钾标准使用溶液(4.6.2)制得的校准系列完成全部分析步骤，于波长220和275nm处测定吸光度后，分别按下式求出除零浓度外其他校准系列的校正吸光度As和零浓度的校正吸光度Ab及其差值ArTOC\o"1-5"\h\zAs=As220-2As275 (2)Ab=Ab220—2Ab275 (3)Ar=As—Ab (4)式中：AS220——标准溶液在220nm波长的吸光度；AS275——标准溶液在275nm波长的吸光度；Ab220——零浓度(空白)溶液在220nm波长的吸光度；Ab275——零浓度(空白)溶液在275nm波长的吸光度。按Ar值与相应的NO3-N含量®g)绘制校准曲线。结果的表示8.1计算方法按式(1)计算得试样校正吸光度Ar，在校准曲线上查出相应的总氮pg数，总氮含量(mg/L）按下式计算:式中：m——试样测出含氮量，Mg；V 测定用试样体积，mLo精密度与准确度9.1重复性21个实验室分别测定了亚硝酸钠，氨基丙酸与氯化铵混合样品；CW604氨氮标准样品；L－谷氨酸与葡萄糖混合作品。上述三种作品含氮量分别为1.49,2.64和1.15mg/L,其分析结果如下：各实验室的室内相对标准偏差分别为2.3,1.6和2.5%。室内重复测定允许精密度分别为0.074，0.092和0.063mg/Lo再现性上述实验室对上述三种统一合成样品测定。实验室间相对标准偏差分别为3.1%,1.1%和4.2%；再现性相对标准偏差分别为4.0%，1.9%和4.8%；总相对标准偏差分别为3.8，1.9和4.9%o准确度上述实验室对上述三种统一合成样品测定,实验室内均值相对误差分别为6.3%,2.4%和8.7%o室内单内相对误差分别为7.5%,3.8%和9.8%。实验室平均回收率置信范围分别为99.0±6.4%,99.0±5.1%和101±9.4%o附加说明：本标准由国家环境保护局规划标准处提出。本标准由上海市环境监测中心负责起草。本标准起草人戴克慧。本标准委托中国环境监测总站负责解释。实验1总氮量的测定微量凯氏（Mirco-Kjeldahl）定氮法一、 目的1、 学习微量凯氏定氮法的原理2、 掌握微量凯氏定氮法的操作技术,包括标准硫酸铵含量的测定,未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。二、 原理凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氮基酸等）的含氮量。天然的含氮有机物与浓硫酸共热时,其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水,而氮则变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”但是,这个反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点,并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下：CHCOOH+3HSOT2C0t+3SOt+4HO+NHt2 4 2 2 2 3NH22NH+HSOT（NH）SO2 4 42 4浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氮，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量，一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。（NH4）SO+2NaOHTNaSO+2NHOHTOC\o"1-5"\h\z2 4 2 4 4NHOHTHO+NH3t42NH+HBOTNHHBO3 3 3 4 2 3NHHBO+HCLTNHCL+HBO2 3 4 3 3滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5・2~5.6,将NHHB0的蓝色滴423至原来HB0的蓝紫色即为终点。3 3本法适用范围0.2~1.0毫克氮。相对误差应小于2%。三、材料、试剂与器具（一）材料人的血清或猪的血清（二）试剂1、浓硫酸（化学吨）2、30%氢氧化钠（分析纯）溶液3、 0.9%NaCl溶液4、 硫酸钾一硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜（CuSO、5H0）以3：1（W/W）的配比混42合研磨成粉末。5、 2%硼酸6、 混合指示剂的配制：方法一：取50毫升0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200毫升0.1%甲基红无水乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏。方法二：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10毫升与0.1%甲基红乙醇溶液2毫升混和即成。本指示剂的变色范围为pH5.2T5.4T5.6紫红色灰色绿色7、 0.0100MHCl8、 硼酸一指示剂混合液：取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可。（约加1毫升左右混合指示剂）标准硫酸铵溶液（0.3毫克氮/毫升）（三）、器具1、凯氏烧瓶2、消化架3、吸量管（1毫升、2毫升）4、 量筒（10毫升）5、 凯氏定氮蒸馏装置6、微量滴定管（3毫升、5毫升，可读至0.02毫升）7、锥形瓶（50~100毫升）8、容量瓶（50毫升）四、操作步骤（一）样品的处理血清样品：取人血（或猪血），放于离心管中，于冰箱中放置过液，次日离心除去凝血块，上层黄色透明清液即为血清。准确吸取血清1.0毫升加入0.9%NaCl4.0毫升，仔细混匀备用。固体样品：某一固体样品中的含氮量是100克该物质（干重中所含氮的克数）来表示（%）。因此在定氮前，应将固体样品中的水份除掉。一般样品干燥的温度都采用105°C,因为非游离的水都不能在100C以下烘干。在称量瓶中称入一定量的磨碎的样品，然后置105C的烘箱内干燥4小时。用坩埚将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称量一次，直到两次称量的数量不变，即达恒重。（二）消化取2个50毫升的凯氏烧瓶，向第一号烧瓶内加2毫升稀释血清溶液（或4毫升核酸制品溶液，或200毫克固体粉末）。注意，用吸量管直接将溶液（或用试管加入固体样品）加至烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上，向2号烧瓶加入2毫升水作空白对照。在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物约0.2克，浓硫酸3毫升，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出so2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10毫升（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶内容物转入50毫升的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。（三）蒸馏1、仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。蒸馏器（图1-1）有几种，应用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：开放自来水龙头，使水E进入G,从K管流出（水不宜开得过大以免水从G管溢出）。开放P3,使水进入A室，漏斗D中加蒸馏水约10毫升入B室。用拇指将管口按紧，同时开放P],则B室中的水先从Y型管口冲出，随后A室中水经K管流出，一般情况下如此重复洗涤两次即可。若蒸馏器内有氨存在，则应加入蒸馏水后，不加样品蒸馏一次方可使用。（可用PH试纸检查。）A为蒸气发生室，P3为其开关，P]为出水开关，B为蒸馏室，与出气室M相遇，M管插入盛有定量酸液的锥形瓶，B室内有Y型管，一端与A室相通，另一端经P与漏斗D相连，4可经此将样品及试剂加入B室，F为指形冷凝管，E为进水管，水经F、G、K而流出，蒸馏

时B室进消化好的样品及NaOH,二者反应产生氨，B室经M管进入锥形瓶中的酸吸收。图1-1凯氏微量定氮蒸馏装置行蒸馏。4、滴定：蒸馏完毕，用0.0100N标准盐酸溶液滴定锥瓶内溶液至淡紫色或灰色，记录所用盐酸的量。（四）计算（A—B）X0.0100X14样口口的总氮含量（克氮％）= x100CX1000若测定的样品含氮量部分只是蛋白性，（如血清）则：样品的总蛋白含量（克蛋白%）(A样品的总蛋白含量（克蛋白%）(A—B)x0.0100x14x6.25Cx1000x100式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14