第一章-紫外可见分光光度计课件-201009-

仪器分析曾瑾生命科学学院分光光度技术(分光光度法)主要是指利用物质特有的吸收光谱来鉴定物质性质及含量的技术，其理论依据是Lambert和Beer定律。第一章紫外可见分光光度技术紫外可见吸收光谱法的应用可进行定量分析，可用来对紫外可见光区具有吸收的物质进行定性鉴定和结构分析，可用于测定有关的化学或物理化学常数，如平衡常数、配合物的配位比等。利用紫外可见吸收光谱法进行定量分析时，具有以下特点：①灵敏度高

一般可测定10-6g级的物质，在某些条件下，甚至达10-9g级的物质，适用于微量组分的测定；②准确度高

相对误差一般可达1％以下；③选择性好

复杂组分的系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质：④操作简便

分析速度快；⑤应用范围广

可用于无机物和有机化合物的定量测定，不仅用于微量组分的测定，还用于常量组分(用示差分光光度法)和多组分混合物的测定。

第一节

基本原理

一、光分析法及其特点

(

opticalanalysisanditscharacteristics)

光分析法：基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法；电磁辐射范围：射线～无线电波所有范围；相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；光分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可区代的地位；三个基本过程：（1）能源提供能量；（2）能量与被测物之间的相互作用；（3）产生信号。基本特点：（1）所有光分析法均包含三个基本过程；（2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3）涉及大量光学元器件。二、电磁辐射的基本性质

basic

propertiesofelectromagneticradiation

电磁辐射（电磁波）：以接近光速（真空中为光速）传播的能量；

c=λν=ν/σ

E=hν=hc/λc：光速；λ：波长；ν：频率；σ：波数；E：能量；h：普朗克常数电磁辐射具有波动性和微粒性；辐射能的特性：(1)吸收物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；(2)发射将吸收的能量以光的形式释放出；(3)散射丁达尔散射和分子散射；(4)折射折射是光在两种介质中的传播速度不同所造成的；(5)反射(6)干涉干涉现象；(7)衍射光绕过物体而弯曲地向其后面传播的现象；(8)偏振只在一个固定方向有振动的光称为平面偏振光。按照产生光谱的物质类型的不同（1）原子光谱与分子光谱和固体光谱气态原子发生能级跃迁时，能发射或吸收一定频率的电磁辐射，经过光谱仪所得到的一条条分立的线状光谱，称为原子光谱。处于气态或溶液中的分子，当发生能级跃迁时，所发射或吸收的是一定频率范围的电磁辐射组成的带状光谱，称为分子光谱。炽热的固体物质及复杂分子受激后，发射出波长范围相当广阔的连续光谱，称为固体光谱。三、光分析分类typeof

opticalanalysis

（2）吸收光谱与发射光谱当物质受到光辐射作用时，物质中的分子或原子以及强磁声中的原子核吸收了特定的光子后，由低能态（一般为基态）被激发跃迁到高能态（激发态），此时如将所吸收的光辐射记录下来，得到的就是吸收光谱。吸收了光能处于高能态的分子或原子，其寿命很短，当它们回到基态或较低能态时，有时重新以光辐射形式释放出来，由此获得的光谱就是发射光谱。

光谱法——基于物质与辐射能作用时，分子发生能级跃迁而产生的发射、吸收或散射的波长或强度进行分析的方法；原子光谱、分子光谱、非光谱法原子光谱（线性光谱）：最常见的三种基于原子外层电子跃迁的原子吸收光谱（AAS）；原子发射光谱（AES）、原子荧光光谱（AFS）；基于原子内层电子跃迁的X射线荧光光谱（XFS）；基于原子核与射线作用的穆斯堡谱；分子光谱（带状光谱）：基于分子中电子能级、振-转能级跃迁；紫外光谱法（UV）；红外光谱法（IR）；分子荧光光谱法（MFS）；分子磷光光谱法（MPS）；核磁共振与顺磁共振波谱（N）；非光谱法：不涉及能级跃迁，物质与辐射作用时，仅改变传播方向等物理性质；偏振法、干涉法、旋光法等；

光分析法光谱分析法非光谱分析法原子光谱分析法分子光谱分析法原子吸收光谱原子发射光谱原子荧光光谱X射线荧光光谱折射法圆二色性法X射线衍射法干涉法旋光法紫外光谱法红外光谱法分子荧光光谱法分子磷光光谱法核磁共振波谱法光谱分析法吸收光谱法发射光谱法原子光谱法分子光谱法原子发射原子吸收原子荧光X射线荧光原子吸收紫外可见红外可见核磁共振紫外可见红外可见分子荧光分子磷光核磁共振化学发光原子发射原子荧光分子荧光分子磷光X射线荧光化学发光原子光谱为线状光谱，分子光谱为带状光谱；为什么分子光谱为带状光谱？原子光谱图分子光谱图1.分子中的能量E=Ee+Ev+Er+En+Et+Ei分子中原子的核能：En分子的平移能：Et电子运动能：Ee原子间相对振动能：Ev分子转动能：Er基团间的内旋能：Ei在一般化学反应中，En不变；Et、Ei较小；

E=Ee+Ev+Er分子产生跃迁所吸收能量的辐射频率：

ν=ΔEe/h+ΔEv/h+ΔEr/h四、物质对光波的吸收原理2.双原子分子能级图分子中价电子位于自旋成对的单重基态S0分子轨道上，当电子被激发到高能级上时，若激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为单重激发态，以S1、S2、······表示；反之，称为三重激发态，以T1、T2、······表示；单重态分子具有抗磁性；三重态分子具有顺磁性；跃迁致单重激发态的几率大，寿命长；3.跃迁类型与分子光谱分子光谱复杂，电子跃迁时带有振动和转动能级跃迁；分子的紫外-可见吸收光谱是由纯电子跃迁引起的，故又称电子光谱，谱带比较宽；分子的红外吸收光谱是由于分子中基团的振动和转动能级跃迁引起的，故也称振转光谱；分子的荧光光谱是在紫外或可见光照射下，电子跃迁至单重激发态，并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发态的最低振动能级，再跃回基态或基态中的其他振动能级所发出的光；分子的磷光是指处于第一最低单重激发态的分子以无辐射弛豫方式回到第一最低三重激发态，再跃迁回到基态所发出的光；当一束紫外可见光(通常为200—800nm)照射分子时，若分子的某些价电子的能级差ΔE电恰好与某一定频率(或波长)的光相适应时(即ΔE电＝E2-E1=hv)，则该频率(或波长)的光被该物质选择性吸收，价电子由基态跃迁到激发态，将物质对光吸收的情况以波长λ为横坐标，对不同波长光的吸收程度A为纵坐标，绘制的A一λ曲线即为紫外可见吸收光谱，也叫紫外可见吸收曲线，见图。

能量与频率的关系式如下；E=E1-E2=hvE=分子吸收或发射的辐射能E1=电子在起始能级的能量E2=电子在最终能级的能量h=普朗克常数=6．63×10-27尔格·秒

五、朗伯—比尔(Lambert—Beer)定律

1．朗伯定律

-lgT=-lg（It/I0）=lg（I0/It）∝L将上述比例式写成等式，得到lg（I0/It）=K1L式中lg（I0/It）称为吸光度(A)(absorbance)，又称为消光度(E)(degreeofextinction)或光密度(D)(opticaldensity)。所以A=K1L2．比尔定律lg（I0/It）=K2CA=K2C式中C为有色物质溶液的浓度；K2为比例系数，其值取决于入射光的波长，溶液的性质和液层的厚度，以及溶液的温度等。

3．朗伯—比尔定律如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收的影响，则必须将朗伯定律和比尔定律合并起来，得lg（I0/It）=KLCA=KLC第二节

分光光度技术的应用

一、紫外可见吸收光谱与分子结构的关系

1、紫外可见吸收光谱与电子跃迁从化学键性质来看，与紫外可见吸收光谱有关的电子是：成键σ电子、成键π电子和未成键的n电子，这三种类型的电子可用乙醛分子示例如下当有机化合物吸收光辐射以后，分子中的电子跃迁方式主要有四种类型，即σ→σ*、n→σ*n→σ，n→π*及π→π*。这四种电子跃迁所吸收的能量(△E)的大小关系为n→π*<π→π*≤n→σ*<σ→σ*

σ*反键轨道π*反键轨道

n非成键轨道π成键轨道

σ成键轨道有机化合物分子的电子能级和跃迁类型

电子能级及跃迁类型图

（1）．σ→σ*跃迁这是成键电子σ被激发到反键σ*轨道所产生的跃迁，饱和碳氢化合物可产生这类电子跃迁。（2）．n→σ*跃迁这是未共用n电子被激发到σ*轨道所产生的跃迁，凡是含有未共用电子对的杂原子(如O、S、N、X)的饱和化合物都可能发生n→σ*跃迁。（3）．π→π*跃迁这是π电子被激发到π*轨道上所产生的跃迁，任何具有双键或叁键的不饱和有机化合物等(C=O，C=C)可发生π→π*跃迁。（4）．n→π*跃迁

这是未共用n电子被激发到π*轨道上所产生的跃迁，这类跃迁一般发生在含有杂原子的双键(如C=O，－N=O，C＝S，

－N＝N－等)不饱和有机化合物中。2、发色团与助色团，长移与短移（1）．发色团与助色团.发色团

能够吸收紫外可见光，产生π→π*或n→π*跃迁的基团称为发色团。助色团有些基团本身不能够吸收紫外可见光，但它与发色团相连时，可使发色团产生的吸收峰向长波方向移动，吸收强度增强，这类基团称为助色团。

（2）．长移与短移长移吸收峰向长波方向移动的这种现象称为长移，又称为红移或深色移动。短移吸收峰向短波方向移动的这种现象称为短移，又称为蓝移、紫移或浅色移动。3、影响紫外可见吸收光谱的因素（1）．共轭效应

当两个或两个以上的发色团被一个单键隔开形成共轭体系时，由于大π键的形成使各能级间能量差减小，使跃迁所需能量减小，吸收峰的波长长移、吸收强度增加的这种效应称为共轭效应。

化合物（共轭）双键数λmax（nm）K乙烯丁二烯已三烯二甲基辛四烯癸五烯123451652172582963351×1042.1×1043.5×1045.2×1041.2×105共轭多烯的吸收情况

（2）．助色效应

当助色团与发色团相连时，助色团的n电子与发色团的π电子共轭，使吸收峰的波长长移，吸收强度增强的这种现象称为助色效应。

（3）．超共轭效应

烷基上的σ电子与共轭体系中的π电子共轭，使吸收峰向长波方向移动，吸收强度增强，这种σ键与π键共轭引起的现象称为超共轭效应。（4）．溶剂效应

由溶剂的极性强弱引起吸收峰波长发生位移，吸收强度和形状发生改变的这种现象，称为溶剂效应。溶剂正已烷氯仿甲醇水

π→π*n→π*230nm329nm238nm315nm237nm309nm243nm305nm长移短移异丙叉丙酮的溶剂效应

（5）．空间效应

由于空间障碍，妨碍两个发