第5章蛋白质工程

蛋白质工程具备的知识基础：分子生物学、分子遗传学、生物化学、微生物学、细胞学及化工、计算技术等蛋白质工程课程的主要任务：1．掌握蛋白质工程科学的基本原理、基础知识2．熟悉蛋白质科学与工程研究的主要方法和技术3．了解蛋白质工程领域的研究方向与最新科技成果蛋白质工程第一节绪论第二节蛋白质结构基础第三节蛋白质分子设计第四节蛋白质的修饰和表达第五节蛋白质理化性质的分析和鉴定第六节蛋白质工程的实际应用蛋白质工程第一节绪论内容

（1）蛋白质化学（2）蛋白质工程2．基本要求

知道蛋白质的概念，了解蛋白质的生物学功能；掌握蛋白质工程的概念；蛋白质工程与基因工程的联系和区别绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别Protein:G.J.Mulder在1838年首次提出。蛋白质是细胞原生质的主要组成成分，其与核酸一起共同构成了生命的物质基础概念：蛋白质是由20种a-氨基酸组成的高分子有机物质,在体内执行多种生理功能蛋白质化学一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质化学一、蛋白质的元素组成

CHONS（50%）（7%）（23%）（16%）

（0～3%）Others:P、Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Se、I磷铜铁锌锰钴硒碘

蛋白质氮元素的含量都相当接近，一般在15%—17％，平均为16％。这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的计算基础

6.25

—16％的倒数，每测定１g氮相当于6.25g的蛋白质。也就是1g氮所代表的蛋白质量（克数）蛋白质含量＝蛋白氮×6.25一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质化学蛋白质的分类

(Classificationofproteins)

(一).依分子形状分类(Classifiedaccordingtoshape)球状蛋白质：血红蛋白、血清球蛋白等纤维状蛋白质：胶蛋白、丝蛋白等(二).依蛋白质组成（Classifiedaccordingtocomposition）简单蛋白质：水解为α-氨基酸结合蛋白质：单纯蛋白质+辅基如色蛋白、糖蛋白、磷蛋白等(三).依蛋白质溶解度（Classifiedaccordingtosolubility）清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白(四).依蛋白质功能（Classifiedaccordingtofunction）活性蛋白质非活性蛋白质一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质化学蛋白质的大小与分子量蛋白质分子量的变化范围很大，从大约6000—1000000道尔顿（Da）或更大某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万道尔顿分子量>6000时，有完整的生物学功能分子量<6000时，不完全有生物学功能。一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质化学

蛋白质的生物功能

Proteinshavemanydifferent

biologicalfunctions

1).酶的催化功能(Enzymaticcatalysis)Firefliesemitlightcatalyzedbyluciferase(荧光素酶)withATP2).运输和储存功能TransportandstorageErythrocytes（红细胞）

containalargeamountofhemoglobins（血红蛋白）,theoxygen-transportingprotein.3).机械功能(Mechanicalfunctions)Theproteinkeratin（角蛋白）

isthechiefstructuralcomponentsofhair,scales,horn,wool,nailsandfeathers.4).运动功能(Movement)striatedskeletalmusclecell5).保护功能(Protection)6).信息传递功能

(Informationprocessing)SimpleAnatomyoftheRetina★蛋白质的生物学意义蛋白质是一切生物细胞和组织的主要组成部分，是生命活动所依据的物质基础2.生物的各种生物功能也都靠蛋白质体现。如细胞结构、生物催化、物质传输、运动、防御、调控以及记忆、识别等方面小结1）发现了数千种不同功能和来源的蛋白质2）其中有上千种蛋白质的氨基酸排列顺序已被测定出来3）上百种已获得高分辨的分子结构解析图这些成就,特别是蛋白质结构与功能的特殊联系方面的成就,为改造蛋白质奠定了关键的基础蛋白质化学的研究成果绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别蛋白质工程诞生：1982年，Winter通过基因定位右边得到了改性的酪氨酸tRNA合成酶1983年，Ulmer在“Science”上发表以“ProteinEngineering”(蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志主要内容：1）根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质2）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系

基本目的：1）实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能2）设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质

蛋白质工程定义：

以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质蛋白质工程绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别蛋白质工程操作流程纯化蛋白质合成寡核苷酸晶体结构模型蛋白质结构功能研究基因文库克隆化基因计算机辅助设计M13克隆分子性质及分子定向改造方案DNA序列分子测试性质表达载体纯化突变型蛋白质突变体1、分离纯化0.1-1.0mg纯蛋白质2、测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针3、以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，转入噬菌体M13系统，用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析4、通过表达载体获得较大量(0.1-1.0克)该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案5、通过寡核苷酸M13系统定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子

绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别1）蛋白质结构分析

2）蛋白质结构预测

3）改造或创造新蛋白质

主要研究方向1、蛋白质结构分析（研究核心）

1）收集大量的蛋白质分子结构的信息2）建立结构与功能之间关系的数据3）蛋白质结构与功能之间关系的理论研究三维空间结构的测定是证明新结构改变了原有生物功能的必需手段蛋白质工程主要事件：1934年，胃蛋白酶的x射线衍射照片J.Bernal,D.Crowfoot1957年，肌红蛋白晶体结构Kendrew1956年，维生素B12晶体结构D.C.Hodhkin1959年，血红蛋白晶体结构Perutz蛋白质结构分析主要技术：晶体学技术（x射线晶体结构分析）：1.对原材料的要求：具有高度的均一性；影响因素有金属离子、辅酶或一些成键的辅助集团的变化或缺失；蛋白质的酶解、氧化和还原；蛋白质的聚合效应等2.晶体生长的生化条件：pH值、离子强度、沉淀剂和添加剂的浓度等因素缺陷：需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克-几十毫克），制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析蛋白质结构分析主要技术：多维核磁共振波谱技术：二维同核核磁共振方法：对氢原子核的二维核磁共振信号进行分析，主要用于β类蛋白质多维异核核磁共振方法：1H、13C、15N，主要用于分子量高于10kDa的蛋白质和α螺旋的多肽优点：样品要求低（蛋白质可溶性、高稳定性、高丰度）；分析液态下的肽链结构。已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。可以更有效地分析蛋白质的突变缺点：仅限于分子量较小的蛋白质蛋白质结构分析研究现状蛋白质空间结构的测定已经成为生命科学的“瓶颈”美国NIH投资1.25亿美元，计划测定1万个蛋白质晶体结构；日本RIKEN将建16台高分辨率核磁共振仪，用来测定小分子蛋白质结构技术上的障碍：在克隆、表达、纯化和结晶过程中，大约20个蛋白质中能得到1个可供结构测定的晶体，并且一些蛋白质（膜蛋白）根本不可能被结晶现阶段主要研究手段根据氨基酸序列从理论上计算其相应空间结构成为蛋白质领域内科学家们的奋斗目标蛋白质结构分析主要研究方向：1）蛋白质结构分析

2）蛋白质结构预测

3）改造或创造新蛋白质

蛋白质工程2、结构预测

1）对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能2）根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构

蛋白质工程1、理论分析方法或从头算方法(Abinitio)：该类方法假设折叠后的蛋白质取能量最低的构象2、统计方法：对已知结构的蛋白质进行统计分析，建立序列到结构的映射模型，进而根据映射模型对未知结构的蛋白质直接从氨基酸序列预测结构。这一类方法包括经验性方法、结构规律提取方法、同源模型化方法等

蛋白质结构预测主要技术：分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能研究现状：尚在起步阶段

蛋白质结构预测主要研究方向：1）蛋白质结构分析

2）蛋白质结构预测

3）改造或创造新蛋白质

蛋白质工程创造和改造蛋白质：1）物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等2）生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等缺点：缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用3）基因重组技术或人工合成DNA：可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质蛋白质工程修饰目标明确在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代，这样就可以将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。一旦目标DNA明确以后，就可以运用定位突变等技术来进行研究蛋白质工程基因工程技术在蛋白质工程中的应用定点突变：改变其中的一个或两个三联密码就可以改变氨基酸盒式突变：1985年Wells提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析PCR技术：直接、快速和高效

高突变率技术：①硫代负链法：核苷酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物（α－（S）－dCTP）对某些内切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核苷酸外切酶III从3｀→5｀扩大缺口并超过负链上错配的核苷酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因②UMP正链法：大肠杆菌突变株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在这种宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）掺入模板而不被修饰。用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠杆菌，结果含U的正链被寄主降解，而突变型负链保留并复制

蛋白质融合：将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等

绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库

F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别蛋白质数据库1、核酸序列数据库EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratory)http://www.ebi.ac.uk/embl/GenBank/GenBank2、蛋白质序列数据库由瑞士SwissInstituteofBioinformatics和

EuropeanBioinformaticsInstitute合建/蛋白质数据库3、蛋白质结构数据库（PDB）由美国BrookhavenNationalLaboratory开发4、蛋白质二级结构数据库（DSSP）WolfgangKabschandChirsSander设计http://www.sander.ebi.ac.uk/dsspftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/dssp蛋白质数据库绪论A蛋白质化学B蛋白质工程概念C蛋白质工程操作流程D蛋白质工程研究方向E蛋白质数据库F蛋白质工程研究成果及存在问题G基因工程概念H蛋白质工程与基因工程的联系与区别蛋白质工程的成果1.基础研究方面:

酪氨酰tRNA合成酶是应用蛋白质工程技术研究得比较深入的酶之一。该酶在ATP存在的条件下可催化酪氨酸活化──酪氨酸转移到tRNA的3'