第八章 基因的表达与调控(下)

第八章基因的表达与调控（下）真核基因表达调控的一般规律真核生物（除酵母、藻类和原生动物等单细胞类之外）主要由多细胞组成，每个真核细胞所携带的基因数量及总基因组中蕴藏的遗传信息量都大大高于原核生物。人类细胞单倍体基因组就包含有3×109bp总DNA，约为大肠杆菌总DNA的1000倍，是噬菌体总DNA的10万倍左右！

真核基因表达调控的最显著特征是能在特定时间和特定的细胞中激活特定的基因，从而实现"预定"的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：

第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。

第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。

转录水平调控；

转录后水平调控；

翻译水平调控；

蛋白质加工水平的调控等。DNA转录初产物RNAmRNA蛋白质前体mRNA降解物活性蛋白质DNA水平调节转录水平调节转录后水平的调节翻译调节mRNA降解的调节翻译后加工的调节核细胞质研究基因调控主要应回答的3个问题：①什么是诱发基因转录的信号？

②基因调控主要是在哪一步（模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成）实现的？

③不同水平基因调控的分子机制是什么？

第一节真核生物的基因结构与转录活性试说明真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA的空间结构方面存在的主要差异，表现在哪些方面？武汉大学2003年分子生物学硕士入学试题①在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。

②真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。

③高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。

④真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。⑤在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5‘上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑RNA聚合酶与它的结合。

⑥真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。

⑦许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能顺利地翻译成蛋白质原核生物真核生物操纵元调控多样化调控，更为复杂基因组小，大肠杆菌：总长4.6×106bp,编码4288个基因,每个基因约1100bp基因组大，人类基因组全长3×109bp，编码10万个基因，其余为重复序列基因分布在同一染色体上，操纵元控制DNA与组蛋白结合成染色质，染色质的变化调控基因表达；基因分布在不同的染色体上，存在不同染色体间基因的调控问题适应外界环境，操纵元调控表达基因差别表达是细胞分化和功能的核心转录和翻译同时进行，大部分为转录水平调控转录和翻译在时间和空间上均不同，从DNA到蛋白质的各层次上都有调控，但多数为转录水平调控原核与真核生物的调控差异A.基因家族（genefamily)真核生物的基因组中有很多来源相同、结构相似、功能相关的基因，将这些基因称为基因家族。如：编码组蛋白、免疫球蛋白和血红蛋白的基因都属于基因家族同一家族中的成员有时紧密地排列在一起，成为一个基因簇(genecluster)

。a、简单多基因家族简单多基因家族中的基因一般以串联方式前后相连。TheeukaryoticribosomalDNArepeatingunitb、复杂多基因家族

复杂多基因家族一般由几个相关基因家族构成，基因家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位。现已发现存在不同形式的复杂多基因家族。

Organizationofhistonegenesintheanimalgenomec.发育调控的复杂多基因家族

珠蛋白基因家族人类发育阶段中血红蛋白组成的变化：所有动物血红蛋白基因的基本结构相同，但在个体发育不同时期却出现不同形式的亚基。发育阶段血红蛋白组成胚胎期（8周前）ξ2ε2

ξ2γ2

α2ε2胎儿期α2γ2成年期

α2δ2

α2β2

B.真核基因的断裂结构基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，为非编码序列所隔开，其中编码的序列称为外显子，非编码序列称内含子。外显子(Exon)：真核细胞基因DNA中的编码序列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。内含子(Intron)：真核细胞基因DNA中的间插序列，这些序列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。指外显子和内含子的交界或称边界序列，它有两个重要特征：内含子的两端序列之间没有广泛的同源性连接区序列很短，高度保守，是RNA剪接的信号序列

5'GT——AG3'外显子与内含子的连接区组成型剪接：一个基因的转录产物通过剪接只能产生一种成熟的mRNA。选择性剪接：同一基因的转录产物由于不同的剪接方式形成不同mRNA。外显子与内含子的可变调控C.真核生物DNA水平上的基因表达调控a、开放型活性染色质结构对转录的影响

按功能状态的不同可将染色质分为：

（1）活性染色质（有转录活性）（2）非活性染色质（没有转录活性）染色质是否处于活化状态是决定转录功能的关键。活性染色质的核小体发生构象改变，具有松散的染色质结构，从而便于转录调控因子和顺式用元件结合和RNA聚合酶在转录模板上滑动。转录前染色质在特定区域发生核小体结构的消除或改变、DNA本身局部结构变化、DNA从右旋到左旋转变等，促使结构基因暴露而诱发基因转录.

处于活跃状态的基因的在染色质上有一个或数个DNA酶I敏感位点（多位于5‘端启动区）比非活跃态基因易被DNA酶I所降解。DNA酶I敏感位点的产生是染色质结构规律变化的结果，该变化使DNA易与RNA聚合酶和其它转录调控因子结合，从而启动基因表达，也易被DNA酶I所降解。b、基因扩增基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。如非洲爪蟾体细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现的基因扩增现象。基因丢失在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。目前，在高等真核生物（包括动物、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。c、基因重排与变换将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因的表达。1、免疫球蛋白的肽链主要由可变区（V区）、恒定区（C区）以及两者之间的连接区（J区）组成，V、C和J基因片段在胚胎细胞中相隔较远。2、在浆细胞成熟过程中，通过染色体内DNA重组把几个相隔较远的基因片段连接在一起，从而产生了具有表达活性免疫球蛋白的基因3、编码V区的基因很多，而只有少数几个基因编码C区；多个V区基因中的一个和C基因组合，产生一条DNA4、V区和C区不同片段在DNA水平上的各种排列组合是形成Ig分子多态性的根本原因D、DNA的甲基化与基因活性的调控a.DNA的甲基化DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化的主要形式：5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG中。原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化。真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：日常型甲基转移酶从头合成型甲基转移酶前者主要在甲基化母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。后者催化未甲基化的CpG成为mCpG，速度很慢。日常型甲基转移酶常常与DNA内切酶活性相耦联，有3种类型。II类酶活性包括内切酶和甲基化酶两种成分，而I类和III类都是双功能酶，既能将半甲基化DNA甲基化，又能降解外源无甲基化DNA。由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失，所以，高等真核生物中CG序列远远低于其理论值。哺乳类基因组中约存在4万个CG序列，大多位于转录单元的5'区。没有甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用，就可能被氧化成为U，被DNA修复系统所识别和切除，恢复成C。已经甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用,它就变为T,无法被区分。因此,CpG序列极易丢失。b、DNA甲基化抑制基因转录的机理：

DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性，从而影响到DNA与蛋白质相互作用方式的改变，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。主要是不利于模板DNA与RNA聚合酶的结合。如：引起B－DNA向Z－DNA过渡启动区DNA上的DNA甲基化密度与基因转录受抑制程度相关，其影响与MeCP1结合DNA的能力成正相关。甲基化CpG的密度和启动子强度间的平衡决定该启动子是否有转录活性。DNA甲基化转录抑制作用机理（1）识别位点中胞嘧啶被甲基化，转录因子不能与其结合（2）特异性识别甲基化DNA的蛋白（如MeCP1）竞争性地抑制了转录因子的结合（3）DNA甲基化导致染色质结构和DNA构象的改变c、DNA甲基化与X染色体的失活

X染色体DNA序列高度甲基化，基因被关闭（1）与X染色体的失活有关的序列：

X染色体失活中心（Xic）

Xist（Xi-specifictranscript）基因转录产物：RNA—不编码蛋白质（2）X染色体的失活的机制：

XistRNA分子与Xic相互作用的结果（3）Xist基因的调控：

DNA甲基化与去甲基化XistX染色体其他位点甲基化、不转录活性去甲基化、活性去甲基化、转录失活甲基化、失活

雌性哺乳动物细胞发育过程中，X染色体随机失活。Xist基因的表达是决定X染色体失活的关键因素。而表达与否与甲基化修饰密切相关。第二节真核基因转录机器的主要组成“基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。A、真核基因的转录启动子增强子反式作用因子启动子是一段特定的直接与RNA聚合酶及其转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA序列。不同的启动子对RNA聚合酶的亲和力不同，所结合的反式作用因子（trans-actingfactors）也不同，因此，基因转录活性也很不相同。启动子：核心启动子(corepromoter)TATA盒，-25—-30bp上游启动子元件(upstreampromotorelements,UPE)：CAAT盒，-70bp；GC盒等，通过TFII复合物来提高转录效率。增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。远离转录起始点（1~30kb），增强启动子转录活性DNA序列。1、增强效应十分明显。2、增强效应与其位置和取向无关。3、大多为重复序列，一般长约50bp。4、增强效应有严密的组织和细胞特异性。5、没有基因专一性。6、许多增强子还受外部信号的调控。增强子的性质一种观点认为，增强子为转录因子提供进入启动子区的位点。第二种认为，增强子能改变染色质的构象。因为增强子区域容易发生从B-DNA到Z-DNA的构象变化。增强子的功能是可以累加的。增强子的作用原理

概念：为DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开放（正调控）或关闭（负调控）通用或基本转录因子(generaltranscriptionfactors)：RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子。TFⅡA、TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE等

特异转录因子(specialtranscriptionfactors)：个别基因转录所必需的转录因子.OCT-2：在淋巴细胞中特异性表达，识别Ig基因的启动子和增强子。反式作用因子(trans-actingfactor)从功能上分析其结构可包含有不同区域：①DNA结合域(DNAbindingdomain)：多由60－100个氨基酸残基组织的几个亚区组成；②转录激活域(Transactivationdomain)：常由30－100氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，以酸性结构域最多见；

③连接区:即连接上两个结构域的部分。不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用于转录复合体而影响转录效率。螺旋-转折-螺旋（Helix-turn-helix，H-T-H）锌指结构（zincfinger）碱性-亮氨酸拉链（basic-leucinezipper）碱性-螺旋-环-螺旋（basic–helix/loop/helix，bHLH）DNA结合结构域是最早发现于原核生物中的一个关键因子，该结构域长约20个aa，主要是两个α-螺旋区和将其隔开的β转角。其中的一个被称为识别螺旋区，因为它常常带有数个直接与DNA序列相识别的氨基酸。这类结构至少有两个α螺旋，其间由短肽段形成的转角或环连接，两个这样的motif结构以二聚体形式相连，距离正好相当于DNA一个螺距(3.4nm)，两个α螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟。螺旋-转折-螺旋（Helix-turn-helix，H-T-H）HTH结构及其与DNA的结合N-端多余臂部分与小沟结合螺旋1和2靠在外侧螺旋3位于DNA的大沟中锌指结构（zincfinger）“锌指”:

据其结构命名,其中一小段保守氨基酸与Zn2+结合,形成一个相对独立的区域。有两类DNA结合蛋白含有这种结构：①典型的“锌指”蛋白质;②类固醇受体

典型“锌指蛋白”(typiczinicfingers)含一连串锌指。单个锌指共有序列为：

Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His

称为Cys2/His2锌指。是由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn构成，形成的结构像手指状。谨慎理解锌指存在的意义：尤其是蛋白质仅含有单个锌指时。锌指可能参与RNA的结合而不是DNA结合，或它与任何核酸结合活性均无关。碱性-亮氨酸拉链（basic-leucinezipper）

这种基序含4-8个亮氨酸，每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基间隔，这导致第7个亮氨酸残基都在螺旋的同侧。又因这类蛋白质都以二聚体形式与DNA结合，两个蛋白质α螺旋上的亮氨酸靠近而形成拉链样结构。二聚体亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链”。肽链氨基端20～30个富含碱性氨基酸结构域与DNA结合。位于螺旋疏水区的亮氨酸相互作用碱性区与DNA相结合碱性区与DNA相结合碱性-螺旋-环-螺旋（basic–helix/loop/helix，bHLH）◆螺旋-环-螺旋蛋白质有一个由40-50个氨基酸残基组成的基序，含有两个两性α螺旋。◆α螺旋由15-16个氨基酸残基组成，两个α螺旋被环隔开。◆螺旋负责二聚体的形成，bHLH蛋白含碱性序列，它在HLH基序附近，负责结合DNA。同源域蛋白（hd)同源域是编码60个保守氨基酸序列的DNA片段，同源转换基因与生物生长、发育和分化有关。许多含有同源转换区的基因具有转录调控功能，同源转换区氨基酸序列可能参与了DNA结合区。最早来自控制躯体发育的基因，其中的DNA结合区与螺旋－转角－螺旋相似，人们把该DNA序列称为同源域盒。主要与DNA大沟相结合。转录活化结构域(transcriptionalactivationdomain)酸性α-螺旋结构域(acidicα–helixdomain)富含谷氨酰胺结构域(glutamine-richdomain)富含脯氨酸结构域(proline-richdomain)共同点：它们之间并不存在较为明显的氨基酸序列的同源性，但却都含有高比例的酸性氨基酸，产生出很强的净负电荷。例如：糖皮质激素受体蛋白质17/82；GCN4为17/60。酸性α-螺旋结构域(acidicα–helixdomain)富含谷氨酰胺结构域(glutamine-richdomain)例：在组成型表达的转录因子SP1的两个最强的激活域中，谷氨酰胺几乎占了25%，而带负电菏的氨基酸比例则非常低。富含脯氨酸结构域(proline-richdomain)

与CCAAT元件结合的组成型转录因子CTF/NF1，转录激活域位于转录因子的C-末端，其中酸性氨基酸及谷氨酰胺所占比例都很低，但含大量的脯氨酸，约占该区域的1/4。如原癌基因蛋白质产物Jun和AP2以及Oct-2中，都鉴定出了富含脯氨酸的激活域。第三节蛋白质磷酸化对基因转录的调控蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。被磷酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。组氨酸和赖氨酸残基也可能被磷酸化。受体分子活化细胞功能的途径：

1、受体/受体结合蛋白具有内源蛋白激酶活性

2、配体＋受体G蛋白介导蛋白激酶（PK）分类：根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基种类分：（1）丝氨酸/苏氨酸型（2）酪氨酸型（3）组氨酸型根据是否有调节物参与蛋白激酶活性分：（1）信使依赖型（2）非信使依赖型(1).在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使，如cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）等，这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响。(2).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶"活性"。与酶的重新合成及分解相比，这种方式能对外界刺激做出更迅速的反应。(3).对外界信号具有级联放大作用；(4).蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应。受cAMP水平调控的A激酶C激酶与PIP2、IP3和DAGCaM激酶与MAP激酶酪氨酸激酶途径蛋白质磷酸化与细胞分裂调控第四节蛋白质乙酰化对基因表达的影响

细胞内的染色质在乙酰化酶（HAT）的催化下，由乙酰CoA提供乙酰基，而被乙酰化修饰。去乙酰化酶（HDAC）催化其脱乙酰化。核小体组蛋白八聚体中，存在32个潜在的乙酰化位点，主要分布在H3和H4，其次为H2A和H2B。组蛋白乙酰转移酶（HAT）HAT可分布在细胞核（A型）或胞浆（B型）。A型HAT复合物包括GNAT、MYST、p300/CBP、BasalTF、NuclearReceptorCo-factors五大家族。因此，有些HAT同时也是转录因子或转录共激活因子.组蛋白乙酰转移酶的分子结构组蛋白乙酰转移酶超家族组蛋白去乙酰化酶（HDAC）

HDAC可分为三大亚家族：ClassI——HDAC1，2，3，8；ClassII——HDAC4~7，9~11；ClassIII——SIRT1~7组蛋白去乙酰化酶的种类在HAT的催化下，乙酰基被添加到组蛋白H3-K9、H3-K14及H4-K8的ε-氨基上。组蛋白被乙酰化修饰后，其核小体八聚体颗粒与DNA的亲和力降低，核小体解聚加速，DNA链松散，转录因子和RNA聚合酶更容易与之结合，促使基因转录。

反之，组蛋白被HDAC去乙酰化后，则导致核小体聚集，异染色质形成和基因沉默。组蛋白乙酰化与去乙酰化对基因表达的影响染色质的结构控制DNA的可接近性与组蛋白乙酰化修饰相关的乙酰化酶都属于CREB结合蛋白的同源蛋白，具有与多种基因表达调节蛋白或转录因子、RNA聚合酶Ⅱ、核受体等的特异结合位点，不仅具有乙酰基转移酶活性，也是一种转录共激活因子。组蛋白的乙酰化修饰状态可通过DNA的复制而从亲代传递给子代。p53乙酰化对转录活性的影响人体抑癌基因。该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，命名为P53。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的两个方面，p53是一个重要的抗癌基因使癌细胞自杀，防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。这种功能对于受化疗药物作用而受伤的癌细胞，则起修复作用，而不是使癌细胞自杀。造成被修复的癌细胞在治疗后成为新的肿瘤。p53人类P53基因定位于17P13.1，鼠P53定位于11号染色体，并在14号染色体上发现无功能的假基因，进化程度迥异的动物中，P53有异常相似的基因结构，约20Kb长，都由11个外显子和10个内含子组成，第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8、分别编码5个进化上高度保守的结构域，P53基因5个高度保守区即第13～19、117～142、171～192、236～258、270～286编码区.P53基因转录成2.5KbmRNA，编码393个氨基酸蛋白，分子量为53KD.P53蛋白N一端为酸性区1～80位氨基酸残基，C-端为碱性区319～393位氨基酸残基，正常的P53蛋白在细胞中易水解.Rb基因是从视网膜纤维瘤中克隆到的另一个抑癌基因，其功能是阻止处于G0／G1期的细胞进入S期，从而控制细胞增殖。正常Rb基因的表达几乎可抑制所有培养细胞的分裂。E2F为转录因子系列，它们可以激活那些对细胞进入S期必须的靶基因。成视网膜细胞瘤：人类儿童疾病，涉及视网膜的肿瘤。当RB基因的两份拷贝均没有活性时，就会产生视网膜母细胞瘤。第五节激素与热激蛋白对基因表达的影响激素－受体复合物与染色质特定区域结合，导致基因转录的起始或关闭。激素应答基因多为顺式作用元件，该序列有类似增强子的作用。激素、受体、顺式作用元件三者的结合才能发挥作用。三种假说：

1、受体流动假说：