高通量测序技术在现代农业中的应用

高通量测序技术在现代农业中的应用

0第二代测序技术自1978年以《双重氧基吡啶反应法》为代表的第一个过程分离技术以来，第一个过程分离技术得到了改进（见图1）。进入21世纪后,以Roche454、IlluminaGA和ABISOLiD测序系统为代表的第二代测序技术诞生了,第二代测序技术具有测序通量高、速度快及测序成本低等优点。随着高通量测序技术在科学研究中的广泛应用,它们逐渐成为了新一代高通量测序技术的代表者并为广大科研工作者所接受。测序技术的快速发展为现代农业科学的研究进步起到了巨大的推动作用。测序技术逐渐应用到农业科学研究的多个领域,如作物分子育种、动植物抗病基因、抗逆基因的筛选、作物经济性状的发育机理等研究,并取得了重大的进展。本研究综述了高通量测序技术在现代农业研究中的主要应用并展望了今后的研究发展方向,希望为今后的科学研究打下基础。1基于人基因组测序的第二代溶血压测序第二代测序技术以高通量及低成本为其主要特征,并在此基础上保持了第一代测序技术的高准确性。利用高通量测序技术只需要1周即可完成第一代Sanger测序技术花费3年完成的人基因组测序任务。由于第二代测序技术能够对1个物种的基因组和转录组进行深入细致的研究,因此又被称为深度测序技术(deepsequencing)。1.14单链dna测序和序列测定Roche公司的454测序系统是第二代测序技术中第1个商业化运营的测序平台。454测序仪利用焦磷酸法测序,其技术原理是:454测序仪首先利用微乳滴PCR技术(emulsionPCR,emPCR)来生成扩增产物。将固化引物的微球与单链DNA文库模板以及必要的PCR反应化合物一起混合,微球与文库片段的比例适当,以确保大多数微球结合的单链DNA分子不超过1个。水溶液与油混合形成油包水结构乳滴,每个乳滴都是一个进行后续PCR反应的微型化学反应器,经过多轮热循环,每个微球表面都结合了数千个相同的DNA拷贝,然后富集微球,转移并放置到刻有规则微孔阵列的微孔板上,每个微孔只能容纳一个微球,微孔板被安装成为流通池的一部分,其中一面可以通过测序反应的化合物,另一面则与CCD光学检测系统的光纤部件相接触。碱基测定采用边合成边测序,利用焦磷酸法产生的光学信号来进行检测,通常所说的焦磷酸测序法是利用ATP硫酰化酶和荧光素酶在三磷酸核苷结合到DNA链上的时候释放焦磷酸,通过ATP硫酰化酶和荧光素酶产生一系列级联反应,导致生物化学发光放出光信号。测序是顺次向流通池中加入4种dNTP中的一种,每个微孔之中有或是没有光信号释放出来分别表明dNTP连接到片段上或者不是互补的核苷酸,这样也就确定了DNA模板上的互补碱基。对每个小孔中的DNA片段分子进行准确快速的碱基序列的测定。454技术平台平均读取长度达到400bp,使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。1.2桥式桥式pcr和dntp的合成Illumina公司的GenomeAnalyzer于2006年问世,它是基于Solexa技术的测序系统。Illumina/Solexa测序技术的基本原理是边合成边测序(sequencingbysynthesis,SBS),把待测序列打断成200~500bp的小片段,并在小片段两端加上不同的接头,连接载体,构建ssDNA文库。DNA与流动槽(flowcell)的附着力将这些ssDNA随机地附着在流动槽表面的channel上。流动槽是一种含有8个channel的微纤维板,它的表面固定有很多接头,能支持ssDNA在其表面进行桥式扩增。向反应体系中添加未标记的核苷酸和酶,进行桥式PCR(BridgePCR)扩增反应。BridgePCR以流动槽表面固定的接头为模板,经扩增将桥型ssDNA扩增成桥型dsDNA。将桥型dsDNA变性成ssDNA,继续扩增。经过不断的扩增变性循环,每种ssDNA都在各自的位置集中成束(cluster),每束含有单个模版分子的500~1000个克隆拷贝,从而达到能支持下一步测序反应所需信号强度的模板量。“DNAcluster”在GenomeAnalyzer综合分析仪上进行序列分析。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。由于这些dNTP的3´羟基被化学方法保护,因而每轮合成反应都只能添加1个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后,所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱。加入激发荧光所需的缓冲液,用激光激发荧光信号,用光学设备完成荧光信号的记录,再通过计算机分析转化为测序结果。当荧光信号的记录完成后,加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP的3’羟基保护基团,以便进行下一轮测序反应。如此反复,得出片段的精确序列。Solexa技术的读取长度可以达到2×75bp,相比454技术,其后续的序列拼接工作的计算量和难度均大大增加,该平台的测序通量是传统平台(第一代测序仪)的数千倍。1.3连接酶-八聚核苷酸法ABI公司的SOLiD测序系统于2007年10月投入商业使用,它基于连接酶测序法,即利用DNA连接酶在连接过程中进行测序,即边连接边测序。SOLiD测序的基本原理是:SOLiD测序样品制备方案与前2种技术有类似之处,首先也是待测DNA文库的构建,把待测序列打断成很小的片段,并在小片段两端加上不同的接头,连接载体,构建ssDNA文库。然后与454技术的EmulsionPCR类似,将带接头的ssDNA固定在磁珠表面,进行PCR扩增,并对扩增产物进行3’端修饰。将3’端修饰的磁珠沉积于上样玻片(slide),进行连接酶测序。在沉积过程中可对磁珠密度进行调节,以达到最大通量。向体系中加入DNA连接酶、通用测序引物n和具有3’-XXnnnzzz-5’结构的八聚核苷酸。在这个八聚核苷酸中,第1和第2位(XX)上的碱基是确定的,并根据种类的不同在第6~8位(zzz)上加了不同的荧光标记。这种由2个碱基决定的测序方法被称为两碱基测序(twobaseencoding)。当八聚核苷酸由于第1和第2位配对而被连接酶连接上时,会发出荧光。在记录下荧光信息后,通过化学方法在第5和第6位之间进行切割,淬灭荧光信号,以进行下个位置的测序。通过这种方法,每次测序的位置都相差5位,即第1次测第1和第2位,第2次测第6和第7位……在测到末尾后,将新合成的链变性、洗脱。而后用通用测序引物n-1进行第2轮测序。通用测序引物n-1与通用测序引物n的差别是,二者在与接头配对的位置上相差1个碱基,即通用测序引物n-1在通用测序引物n配对位置上向3’端移动了1个碱基。因此在加入DNA连接酶和八聚核苷酸后,可以测定第0和第1位、第5和第6位……第2轮测序完成后,接下来再分别加入通用测序引物n-2、通用测序引物n-3、通用测序引物n-4进行第3轮、第4轮、第5轮测序,最终可以完成全部位置的测定,并且每个位置均被测定了2次。SOLiD技术每个循环可以测2个上样玻片,读取长度可达2×50bp,与Solexa技术类似,后续的序列拼接工作也比较复杂。1.4第三代测序技术新近研发的Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、PacificBiosciences公司的SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子技术,被认为是第三代测序技术。Heliscope技术和SMRT技术是利用荧光信号进行测序,纳米孔单分子技术是利用不同碱基产生的电信号进行测序。第三代测序技术已逐渐被科学家关注,将会逐渐应用于科学研究,解决众多的农业科学问题。第三代测序技术是通过增加荧光的信号强度及提高仪器的灵敏度等方法解决错误率的问题,使测序不再需要PCR扩增这个环节,实现了单分子测序并继承了高通量测序的优点。第三代测序技术里的纳米孔单分子技术则更是在原理上做出本质变革,不再基于目前所用测序技术广泛使用的边合成边测序的思想,而是使用外切酶从ssDNA的末端逐个切割形成单碱基,并采用新技术对切落下来的单碱基进行检测,这样可以更好地提高读取长度,减少测序后的拼接工作量,实现对未知基因组进行重新测序。2高流量法测序技术在农业科学研究中的应用2.1高流量跟踪技术在dna水平上的应用2.1.1多测序平台合作进行的测序效率获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。对于一些基因组未被测序过的生物,其基因组测序需要从头测序。从头测序也称denovo测序,其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序,利用生物信息学分析手段对序列进行拼接、组装,从而获得该物种的基因组图谱。科研工作中,常结合Solexa/SOLiD技术的高通量和454技术或传统的Sanger测序技术的较长读长的优势来共同完成从头测序工作,利用多测序平台可以大大降低测序成本,提高测序速度,保证测序结果准确性。例如Huang等完成的黄瓜全基因组测序,结合了传统的Sanger测序技术和第二代IlluminaGA测序技术,得到了26.5×109个高质量碱基,平均72.2倍覆盖度的黄瓜基因组序列,其中Sanger测序技术得到3.9倍,IlluminaGA得到68.3倍覆盖度,IlluminaGA读取长度为42~53bp。Dalloul等利用Roche454和IlluminaGA技术完成了火鸡基因组的从头测序。其中,454技术完成5倍测序深度,GA技术完成20倍测序深度。测序结果覆盖了覆盖火鸡基因组90%(0.92/1.1Gb),发现6mol/LSNP,预测1.6×104个基因。2.1.2玉米重测序的研究在已知物种基因组的情况下,对物种内的不同个体或某个个体的不同组织进行基因组重测序,可以再全基因组水平上发现不同个体或组织细胞之间的差异。通过这种方法,可以寻找出大量的单核苷酸多态性位点(SNP),插入缺失位点(InsertionDeletion,InDel),结构变异位点(StructureVariation,SV),拷贝数变异(CNV,CopyNumberVariation)等变异信息,从而获得生物群体的遗传特征。利用高通量测序技术获得测序结果,对照参比基因组(referencegenome),依靠后期强大的生物信息学分析能力,可以轻松完成基因组重测序过程。2007年vanOr-souw等利用454测序技术并结合改进的AFLP技术对玉米基因组进行了重测序,证实了超过75%预测的玉米SNPs的存在;Hillier等利用SOLiD测序技术对8个家鸡品系和1个野生品系进行测序,测序完成44.5倍测序深度,测序覆盖度达92%发现7×106个SNP位点,约1300插入/缺失位点。2.2工会水平应用2.2.1转录组实验和基因表达谱基因表达谱是指生物细胞在特定的条件下表达的所有基因。分析基因表达谱是了解生物组织或器官行使各项功能的分子基础及环境和胁迫影响生物的分子机制等的重要手段。以往的基因表达谱分析主要依靠基因芯片(DNAmicroarray)技术,但基因芯片技术对基因表达谱的分析存在许多不足,它依赖于特定探针的杂交;背景噪音及假阳性率高;检测灵敏度较低;只能检测部分模式生物;无法检测出低丰度基因和新转录本。高通量测序技术克服了以上技术中存在的不足,它能对样品进行深度测序,捕获样品中低表达的基因,而且还可以对大量样品同时测序并获得样品之间基因的表达差异。在RNA水平上除了可以对基因表达谱进行研究外,还可以进行转录组的mRNA的研究。高通量测序技术还能对特殊物种的MicroRNAs进行鉴定,对低表达的、保守的或者高表达的MicroRNAs的研究更为便利。此外,研究人员还可以获得转录本的表达丰度、转录发生位点、可变剪切、转录本SNP以及发现新的转录本等重要信息。高通量测序技术将成为从全基因组水平上研究基因表达的主要方法。基因表达谱分析技术适合研究不同样品中的差异表达基因,并且具有费用低,效率高的优势。通过高通量测序直接研究转录组谱,能够灵敏准确的得到更接近细胞内真实状态的转录组。Xiao等首次应用Illumina的数字基因表达谱技术研究宿主在感染N-PRRSV(经典北美型PRRSV)CH1a株病毒后,其转录水平对病毒作出的响应机制。研究发现在被感染的家猪中N-PRRSV呈现出多种破坏机制,包括破坏宿主细胞的先天免疫反应、抗凋亡和抗发炎能力。受病毒诱导后表达上调的早期炎性相关细胞因子、趋化因子、粘附分子、发炎相关酶蛋白、发炎细胞、抗体以及补体等很可能导致了N-PRRSV感染过程中发炎响应机制的发生和发展。Zoltan等用基因表达谱技术研究了被分支杆菌侵染的斑马鱼的转录组变化,从每个样品中得到了上百万的转录标签,发现了被分支杆菌感染后诱导产生的新基因和新的转录机制,更好的阐明了与传染病有关的转录组反应。Wang等研究了野生型和突变型棉花的毛状体,利用DGE技术阐明纤维细胞的分裂和延长过程。测序结果发现纤维细胞发育过程中差异表达量最高的基因是纤维素合成酶基因、磷酸(脂)酶基因和脱氢酶基因,很可能是这些基因参与调控了纤维细胞的发育。利用solexaRNA高通量测序技术开拓了在生物学领域的视野,得到了许多利用传统技术所不能得到的发现。2.2.2转录组测序技术转录水平的调控是生物体最主要的调控方式,在植物的正常生长,抗旱、抗逆、以及优良品系培育等过程中细胞的基因表达模式会发生显著变化。第二代测序技术可对单个细胞样品中的所有RNA即整个转录组进行整体测序,对每个细胞中表达1~50000个拷贝mRNA的基因都能够检测,该技术还可以检测以前没发现过的基因或新的转录本。通过转录组测序可以让您快速掌握在您感兴趣的植物性状中起重要功能的基因,促进育种或者相关农业应用研究的进程。与基因表达谱分析法相比,转录组测序(RNA-seq测序)方法对阐明转录组的复杂性,基因的鉴定,转录本的结构,可变剪接和新转录本的发现来说是一种更为有利的方法。Sara等运用转录组测序技术(RNA-seq测序)对葡萄(Vitisvinifera)果实发育过程中复杂转录特征的研究。结果鉴定出85870个SNP,发现385个基因具有可变剪切(alternativesplicing,AS),鉴定了新的基因,发现了glutathione-S-transferase(GST)家族的53个新基因和MYB转录因子家族中28个新基因,因为这些基因表达丰度低、缺少探针序列而无法被芯片检测到;Zhang等运用RNA高通量双向深度测序技术,首次展现了水稻8个组织部位的转录本表达图谱全貌,并且能够精确检测到丰度非常低的转录产物,获得相当可观数量的全新转录本、外显子、非编码区。经生物信息学基础分析和深度分析,揭示了顺式剪接在水稻基因中占33%以上,234个推测嵌合转录本可能由反式剪接产生,大量融合转录本可能是可变剪接的副产品,其数据量和信息量远远高于已有报道。Shi等利用Illumina高通量技术获得茶叶C.sinensis转录组信息,通过深度分析,大概得到34.5×106的数据量,经过整理组合得到127094个unigenes,平均长度在355bp,这些数据差不多是现存于GenBank数据库中的10倍左右。Wei等研究者利用Illumina的末端配对测序技术对5种系列的芝麻进行了转录组的测序。测序分析获得的86222unigenes,平均长度在629bp。其中54.03%在NCBI和SwissProt上找到注释,25.52%在KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomesPathwaydatabase)上绘制出119条路径。44750unigenes与拟南芥的15460基因具有同族关系。此外,新现了7702SSRs(EST-SSR),随机选择其中的50个EST-SSRs进行扩增验证,并确定基因组DNA富集的多样性的程度。结果发现有40对引物顺利地扩增了DNA片段,在24个位置上有重要的多态性现象。2.2.3其他特殊处理条件下抗盐活性材料的表达小分子RNA(SmallRNA)或非编码RNA(ncRNA)研究是高通量测序另一个被广泛应用的领域。小分子RNA是一类长约20~30个核苷酸的非编码RNA分子,数量巨大、种类繁多,它们参与了许多重要的生物发育过程。自从1993年SmallRNA首次在秀丽线虫(Caenorhadits,elegans)中被发现,人们逐渐地意识到小分子RNA在生物发育过程中的重要作用。在模式生物中(水稻、拟南芥),利用传统的cDNA文库方法广泛的研究已经发现了MicroRNAs并分析了它们的功能,但是这是一种非常繁琐的方法,而且只能够得到高表达量MicroRNAs不能检测到在少量细胞中低表达的MicroRNAs。MicroRNAs的表达情况随着各种生物和非生物胁迫的发生而发生变化。如Sunkar等对逆境条件干旱、高盐和正常条件下的水稻4周幼苗采用454-FLX法进行miRNA测序,3种处理分别得到102876、54016和174530测序序列(43003、80990、58781个miRNAs),对这些特定处理条件下获得的MicroRNAs的进一步研究,有望揭示小分子RNA在植物组织发育和应答环境胁迫中的重要作用,为阐明植物抗旱抗盐的分子机理提供重要的线索。Nobuta等利用IlluminaSolexa测序技术比较分析了野生型玉米和mop1(mediatorofparamutation1,拟南芥rdr2的同源基因)突变体的小分子RNA的情况。结果发现mop1中长度24nt的siRNA(SmallinterferingRNA)显著减少,而MicroRNAs和tran-siRNA明显富集。另外,在玉米mop1突变体中出现了大量长度22nt的siRNA。这种现象在拟南芥rdr2突变体中则没有发现,说明在拟南芥和玉米小分子RNA的合成过程中,RDR2的功能有所不同。Tina等应用solexa高通量测序技术鉴定了鸡胚胎发育过程中表达的小分子RNA,鉴定出了85个已知的MicroRNAs,6个高丰度富集的reads很可能是新发现的小分子RNA,为丰富MicroRNAs的种类提供线索。正如组织特异表达的蛋白编码基因一样,组织或发育阶段特异表达小分子RN