单壁纳米碳管对小鼠灌胃给药的生物安全性研究

单壁纳米碳管对小鼠灌胃给药的生物安全性研究

1991年，纳米碳管（cnt）发现，主要分为两类：单壁纳米碳管（swt）和多壁纳米碳管（mwt）。SWNT是由单层石墨烯卷成直径为0.4～2nm的圆筒,是理想的分子纤维。其中空结构尤其适用于纳米药物载体。CNT在生物医药有广泛的应用前景,已经成功应用于生物感应器,药物载体和疫苗载体,但是在CNT广泛应用于这些生物医学领域之前,必须评价接触CNT的专业人员的健康问题、安全问题,尤其是作为药物载体应用,生物安全性是必须弄清的首要问题。由于CNT的溶解度非常低,几乎不溶于水且极易团聚等特点,给研究带来极大的困难。目前已有的研究结果大多是关于已修饰的、可溶于水的CNT对全身各组织器官的影响。采用修饰过的CNT虽然解决了它难溶于水的问题,但是从化学概念上讲这种经过修饰的CNT不再是制备人员首先接触到的CNT,而变成是CNT的衍生物。当前,关于CNT毒性的研究主要集中于CNT对活体的肺脏,皮肤以及体外培养细胞的研究。而对于CNT经消化道的研究几乎没有。对于其作为药物载体应用,消化道吸收尤为重要。目前关于CNT的体内分布、生物行为和生物安全性,只有一些间接证据,没有直接证据,更缺乏形态学证据。这里,笔者用未进行任何修饰的SWNT,经胃肠道投用,并对其损伤作用进行研究。1学技术中心某昆明种小鼠,18～22g,雌雄不拘(军事医学科学院动物中心)。SWNT(由国家纳米科学技术中心)。KQ118型超声波清洗器(昆山市超生仪器有限公司),BX-50显微镜(日本OLYMPUS公司),CM120型透射电镜(荷兰Philips公司),日立7020型全自动生化仪(日本日立公司),JT-IR型库而特牌血细胞自动分析仪(美国贝克曼公司)。2方法2.1sw悬浮液的制备取SWNT加生理盐水,超声振动120min,分别制备3.3,6.6,9.9g·L-1的SWNT悬液。2.2swnt的剂量昆明种小鼠40只,18～22g,按照随机分组的方法,每8只小鼠为一组,共分5组。阴性对照组,每只小鼠给予生理盐水0.3mL;阳性对照组,每只小鼠给予体积分数50%乙醇0.3mL;SWNT低剂量组,小鼠按50mg·kg-1剂量灌胃给予3.3g·L-1SWNT的生理盐水悬液0.3mL;SWNT中剂量组,小鼠按100mg·kg-1剂量灌胃给予6.6g·L-1的SWNT悬液0.3mL;SWNT高剂量组,小鼠按150mg·kg-1剂量灌胃给予9.9g·L-1的SWNT悬液0.3mL。2.3特国内二钾抗凝各组连续灌胃给药10d,每天一次。末次给药后6h,小鼠称重并行眼球取血,用肝素及10%EDTA二钾抗凝,备用。经肝素抗凝的血样离心取上清,用日本日立7020全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌酶(CK)。2.4血液检测经10%EDTA二钾抗凝的血液样品,用美国JT-IR型库而特牌血细胞自动分析仪检测血常规。2.5组织固定方法末次给药后6h,取小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、肠、肌肉、淋巴结等组织,于10%甲醛及3%戊二醛溶液固定。分别在光镜及电镜下观察SWNT对各脏器的损伤情况。2.6骨髓切开术取胸骨于Helly液中固定,24h后移入10%的甲醛溶液中继续固定。光镜下检查SWNT对骨髓细胞的抑制情况。2.7统计分析数据以x±s表示,用SPSS软件进行独立样本的t检验。3结果3.1小鼠的异常反应50%乙醇组小鼠,给药数分钟后,步态不稳,安静,呈似醉的样子,其余4组小鼠给药后,基本无异常反应。小鼠进食饮水正常,毛色润泽,活动正常。各组小鼠体重增长正常,结果见表1。3.2胃内脏出血体积分数50%乙醇组小鼠,胃、肠鼓胀,可看到胃内壁有大片出血,肠壁充血,其余内脏未见异常。SWNT各组小鼠,胃及肠内容物为黑色,其余内脏未见异常。3.3swnt的临床表现结果见图1～4。对照组小鼠各脏器的HE染色组织切片均正常。50%乙醇组:观察小鼠HE染色组织切片发现,胃充血,出血,且胃上皮细胞有脱落现象(图1A);脾出血;心肌水肿充血,回肠充血,呈嗜酸性变;肝脏轻度充血(图2A);肾脏基本正常。SWNT对机体的有害效应有明显的剂量依赖性。SWNT低剂量组:仅发现肺泡间隔增宽(图3B),其他组织基本正常(图1B,图2B)。SWNT高剂量组:NSWNT损害了除盲肠以外的所有胃肠道组织。其中,对胃的伤害最严重,表现为渗出,水肿,充血,出血;胃腺细胞嗜酸性变,并且在胃腺细胞中发现蓝染的物质(图1C),机制不明。NSWNT对胃肠道的损伤按十二指肠,空肠,回肠,结肠的顺序依次降低。另外,在透射电镜下观察空肠,回肠,结肠及淋巴组织发现,组织内可以发现很多棒状结构(图4A,B)。NSWNT对内脏的损伤,其严重程度依次为肺,肝,肾,脾和淋巴结。肺组织结构被严重破坏,肺组织间隙出血,肺泡消失(图3A)。肝脏的损伤非常类似于酒精对肝脏的损伤。肝脏有显著的充血,并且肝实质细胞嗜酸性变(图2C)。NSWNT对肾脏的损伤类似于对肝脏的损伤。肾脏实质有显著的充血和出血。心脏的病理变化不同于其他器官,也就是心肌纤维增生,轻度的颗粒变性;脾和淋巴结的损伤相对较轻,仅有轻微充血和小血管相对的增生。在所有被观察的内脏中,脑组织是唯一没有被NSWNT破坏的器官。3.4血液生化指标SWNT组AST,ALT,LDH,CK指标升高。乙醇组ALT和TP升高。血液生化指标检查结果见表2。3.5血液检测SWNT组低、中、高各剂量组红细胞,血小板,白细胞及血红蛋白等均正常。血常规检查结果见表3。3.6骨髓切开术SWNT组低、中、高各剂量组骨髓未见异常。红系、粒系、巨噬细胞系均无异常。4swnt的结构表征纳米粒子进入体内的方式各种各样,其中胃肠道是最可能的途径之一。例如那些经常接触纳米粒子的人员,如不采用适宜的防护措施,纳米粒子进入消化道也是不可避免的。即使在严密防护的情况下,也很难保证完全避免纳米粒子进入胃肠道。因此,本实验对SWNT是否可通过胃肠道进入体内进行研究。物质粒子越小,越容易被胃肠道吸收。SWNT直径不到1nm,因此可能很容易通过消化道黏膜屏障而被直接吸收,如同吸收那些可被直接吸收的物质一样,直接进入血液系统,从而到达体内各脏器。本实验的结果尤其是从组织切片中观察到肺,肝,肾,脾均受到不同程度的损害这一点。推测,SWNT可以通过胃肠道进入生物体。从本实验结果可以看到,给予SWNT灌胃小鼠的血浆ALT和AST值都有明显的升高,并且与SWNT有剂量依赖关系。这提示肝细胞受到了SWNT的损害。SWNT经胃肠道进入体内。首先,由肝门静脉进入肝脏,在肝脏中进行处理,因此SWNT入血后,首先可能被肝脏捕获,因而肝脏也是最先受损伤的器官。肝内富含转氨酶,约为血清中含量的100倍,如果释放的酶保持活性,只要1%的肝细胞坏死便足以使血清中的酶活性增加1倍;又由于肝细胞内转氨酶浓度比血清中高1000～5000倍,在肝细胞膜渗透性增大时,即使无坏死,细胞内转氨酶也由于巨大的浓度梯度而进入血中。因此,转氨酶的升高提示肝细胞膜的通透性增高,这有可能是由于SWNT的表面化学性质所导致,也可能是由于SWNT的物理性质所造成。SWNT中剂量组和SWNT高剂量组血中的LDH值显著性增高,表明这两个组的小鼠体内的细胞受到损害。LDH是一种糖酵解酶,存在于机体所有组织细胞的胞质内,其中以肾脏含量较高,血清中LDH的正常范围为100～300U·L-1,当细胞受到损害时,血清中的LDH就会明显增高。这与文献报道的SWNT可以破坏细胞膜的完整性,导致细胞破裂,死亡相一致。实验小鼠的血常规和骨髓切片检查均正常。推测,SWNT可能不会侵蚀小鼠的造血系统,这与文献报道的SWNT对各脏器产生的有害效应有器官差异性,如肺脏和肝脏较严重,而对骨髓细胞、血细胞及脑组织的有害效应不明显或没有有害效应相一致。在光镜下观察脑的组织切片,脑组织基本正常,没有发现脑组织受到损害,推测,SWNT可能不能通过血脑屏障,这与关于SWNT能通过血脑屏障,进入脑组织的文献结果不同,其原因可能在于SWNT是否经过羟基修饰有关。心肌的组织切片,有轻度的颗粒样变性,形成机制不详,有待进一步研究。羟基化的SWNT经胃肠道给药后,羟基化的SWNT可以在体内的很多组织中广泛分布,包括心脏,肝脏,肺,肾脏,胃,骨,皮肤,脑等。在笔者的实验中,采用灌胃的给药方法,SWNT在胃内的酸性环境和肠道的碱性环境中是否会被修饰,尚有待于进一步研究。目前来看,难溶的SWNT有可能进行了化学修饰,然后进入血液,遍布全身;也有可能不被修饰而以其原型直接进入血液。本实验结果显示,SWNT可以造成多脏器轻重不一的损害,而不能进入脑组织,提示SWNT有可能是以未修饰的形式进入生物体的。但这些结果尚不是结论性的,在目前