培土生金法对脾虚哮喘大鼠模型肺组织水通道蛋白5表达的影响

培土生金法对脾虚哮喘大鼠模型肺组织水通道蛋白5表达的影响

哮喘是一种常见的慢性疾病，呼吸道粘膜分泌过高。气道黏液的黏弹性主要取决于黏蛋白,但是黏蛋白的分泌与水和电解质的分泌是相互调节的,黏蛋白的绝对量增多与黏蛋白和水盐的比例失衡有关［1，2］。水通道蛋白5(aquaporin5,AQP5)可能参与了黏蛋白表达和分泌,从而参与了气道黏液高分泌的形成。AQP5可能成为治疗哮喘、肺囊性纤维化等气道黏液高分泌疾病的新靶点。本课题组前期研究表明,培土生金中药可以显著降低脾虚哮喘大鼠和哮喘大鼠BALF和肺组织中黏蛋白5AC(mucin5AC,MUC5AC)的含量和表达,抑制哮喘大鼠肺组织核因子κBp65的活性,从而减少气道黏液的黏蛋白含量,减轻气道炎症,改善气道黏液高分泌［3，4］。因此,本实验通过观察培土生金中药对脾虚哮喘大鼠模型肺组织AQP5表达的影响,探讨脾虚对哮喘气道黏液高分泌形成的影响机制及培土生金中药对AQP5的调控作用,为研究培土生金中药治疗脾虚哮喘的机制开辟新领域。1材料和方法1.1两组治疗组和治疗组治疗方法1.1.1动物分组:SPF级雄性Wistar大鼠50只,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,体质量(200±20)g,周龄6~8周。许可证编号:SCXK(京)2007-0001。按随机数字法分成5组:对照组、脾虚哮喘组、哮喘组、脾虚哮喘治疗组和哮喘治疗组,每组10只。1.1.2主要试剂和仪器:卵蛋白(货号GradeⅡ,A5253,美国Sigma公司),兔抗大鼠AQP5一抗(武汉博士德生物工程有限公司),TrizolReagent、TaKaRaRNAPCR试剂盒(TaKaRa大连宝生物公司),WD-9413B凝胶成像分析仪(北京六一仪器厂),电泳仪(EPS300型,上海天能科技有限公司),KCW-6T超声雾化器(南京杰西电器有限公司),低温高速冷冻离心机(TGL-20M型,长沙湘仪离心机仪器有限公司),手动石蜡切片机、包埋机(EG1150C型,德国LEICA公司)。1.2项目1:养血性染料模型造模成功后培土生金中药在进行合成时会出现感冒或感冒1.2.1模型的建立和评价:脾虚哮喘组和脾虚哮喘治疗组参考文献的方法并改进,连续10d采用饮食不节、过度疲劳和苦寒泄下等方法共同作用,建立脾虚大鼠模型。当动物出现体质量下降、进水量增多、进食量减少、肛温升高、排便次数增多、便溏、倦怠少动、游泳耐力下降、皮毛光泽度下降等变化,提示脾虚模型造模成功。脾虚造模成功后,脾虚哮喘组和脾虚哮喘治疗组再与哮喘组、哮喘治疗组一起采用致敏和激发的方法建立哮喘模型。在实验的第11、13和15天,腹腔注射抗原液1mL致敏(由卵蛋白100mg、灭活百日咳杆菌疫苗5×109个、氢氧化铝凝胶100mg的生理盐水溶液配制而成)。致敏后第15天开始将大鼠放入雾化箱内,每日将1%卵蛋白溶液用超声雾化器喷雾激发,每次30min,共7d。当激发时大鼠出现呼吸喘促、点头、腹肌抽动等呼吸困难症状,提示哮喘模型造模成功。1.2.2处理因素:造模成功后用培土生金中药,由黄芪、人参、防风、白术等9味中药按比例组成,常规煎煮2次,去渣留液,浓缩为1g/mL生药。按照人鼠剂量换算,折合成人的等效剂量的10倍。从实验的第11天开始对脾虚哮喘治疗组和哮喘治疗组进行灌胃,2次/d,每次1mL/100g体质量,连续21d。1.3pcr扩增条件1.3.1大鼠肺组织湿/干质量比值的测定:右肺下叶称量湿质量后,放入56℃恒温箱烤干,72h后(至衡质量后)称干质量,计算湿/干质量比值。1.3.2大鼠肺组织AQP5mRNA表达:采用Trizol进行肺组织总RNA提取,采用RT-PCR试剂盒分两步进行RT-PCR反应。内参照β-actin和AQP5［6］的引物序列:上游5′-CAGCACTCAAGTGGCCCTCGGCTC-3′,下游5′-AAAGATCGGGCTGGGTTCATGGAA-3′,扩增片段长度500bp。β-actin引物序列:上游5′-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3′,下游5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′,扩增片段长度592bp。PCR反应条件:94℃预变性,2min;94℃变性,30s;65℃退火,30s;72℃延伸,1min;72℃延伸,5min;琼脂糖凝胶电泳;利用WD-9413B凝胶成像分析仪进行图像分析,用Gelpro32软件测量目的基因和内参的平均光密度值,并计算两者的比值,以该比值反映目的基因的mRNA表达水平。1.3.3大鼠肺组织AQP5的表达:采用免疫组化SABC法测定肺组织AQP5表达,采用BI2000医学图像分析系统进行图像分析,选取200倍图像,细胞质或胞膜着棕黄色为AQP5阳性表达细胞,随机选取5个视野进行平均光密度测定,取其平均值作为该切片的代表值。1.4统计学分析实验数据以ue0af±s表示,采用SPSS13.0软件进行统计学分析,多组数据采用单因素方差分析,均数间两两比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1两组肺组织湿/干质量比值比较肺组织湿/干质量比值是用来评估肺水肿或肺水失衡的指标。脾虚哮喘组、哮喘组与对照组比较,脾虚哮喘组与哮喘组比较,肺组织湿/干质量比值均显著升高(P<0.01或P<0.05);脾虚哮喘治疗组与脾虚哮喘组比较,哮喘治疗组与哮喘组比较,肺组织湿/干质量比值均显著降低(P<0.01)。见表1。2.2织aqp5mrna表达水平脾虚哮喘组、哮喘组与对照组比较,脾虚哮喘组与哮喘组比较,大鼠肺组织AQP5mRNA表达水平均显著降低(P<0.01)。脾虚哮喘治疗组与脾虚哮喘组比较,哮喘治疗组与哮喘组比较,肺组织AQP5mRNA表达水平均显著升高(P<0.01)。见表1。2.3各组大鼠肺组织aqp5蛋白表达水平比较AQP5主要表达在肺泡Ⅰ型和Ⅱ型细胞及黏膜下腺。脾虚哮喘组、哮喘组与对照组比较,脾虚哮喘组与哮喘组比较,大鼠肺组织AQP5蛋白表达水平显著降低(P<0.01);脾虚哮喘治疗组与脾虚哮喘组比较,哮喘治疗组与哮喘组比较,肺组织AQP5蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。见表1。3气调和呼吸道黏蛋白表达哮喘是以气道炎症、气道高反应、黏液高分泌及气道重塑为主要病理特征的慢性呼吸道疾病。气道黏液高分泌的形成与黏蛋白和水盐比例失调导致黏液变得稠厚有关。AQPs、氯通道和钠通道等上皮通道蛋白都参与了呼吸道的水盐离子转运,对于调节气道表面液体的成分和厚度等都有重要作用。目前的研究表明,AQP5主要表达在肺泡Ⅰ型上皮细胞和黏膜下腺细胞［7，8］。AQP5是黏膜下腺体液体分泌的主要参与者,黏膜下腺AQP5的减少能导致气道液体分泌减少及黏蛋白浓度增加［9］,AQP5的表达在哮喘发病过程中对改变气道炎性反应及黏液高分泌起着关键作用［10，11］。陈智鸿等［12］研究表明,AQP5的基因缺失可使小鼠气道对过敏原的应激性增加。另有研究报道,AQP5与气道高反应性、气流受限、调节气道水稳态有关［13］。以上研究结果表明AQP5参与了气道黏液分泌,与气道黏液高分泌的形成密切相关,并且与气道高分压有关。因此深入研究AQP5与气道黏液高分泌形成及其与气道黏蛋白表达和分泌调控的相关性,必将为气道黏液高分泌疾病的研究提供靶点。祖国传统医学很早就对体内水的转运和代谢进行了描述,把体内一切正常水液称为津液,包括各脏腑组织的内在体液和其正常分泌物。津液的生成、输布和排泄与各脏腑功能密切相关,特别是肺脾肾三脏。脾为后天之本,主运化水液,为津液代谢之枢纽。脾能将津液上输于肺或直接布散全身,以灌四旁。脾失健运,则水湿内停,而至水饮,痰饮,水泻。脾虚时津液代谢紊乱,影响肺的呼吸功能。气道黏液是气道内正常的分泌物,应属于中医学中的“津液”,气道黏液高分泌是津液代谢紊乱的结果。王艳杰等［3，14］前期实验研究表明,脾虚能够使肺组织MUC5AC表达水平进一步升高及AQP5表达进一步降低,说明脾虚能影响肺组织的津液代谢,引起气道黏液高分泌。本实验通过观察脾虚哮喘大鼠模型肺AQP5表达变化,进一步揭示哮喘气道黏液高分泌形成机制和培土生金法治疗哮喘的机制,为揭示脾与肺在水液代谢中的相关性提供实验依据,为“脾主运化水液”提供分子基础。本实验结果显示:脾虚能够使哮喘大鼠肺组织湿/干质量比值进一步升高,并且还能够使肺组织AQP5mRNA和蛋白表达水平进一步降低。脾虚哮喘和哮喘时肺组织AQP5的表达水平和支气管肺泡灌洗液中MUC5AC含量及肺组织MUC5AC的表达呈负相关,加重哮喘时的肺水失衡,说明肺组织AQP5表达水平和气道黏液中的MUC5AC含量及肺组织MUC5AC表达水平密切相关。由此推测哮喘时肺组织AQP5表达水平降低,可能是导