糖化酶的固定实验

糖化酶的固定化试验一、试验目的定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。二、试验原理糖化酶是一种用途广泛的酶，粮食工业、食品工业、发酵工业都常常使用。随着生物技术的快速进展,糖化酶的生产和使用水平也有了进一步的提高。优点,它开拓了酶的很多用途。游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定征其效果。糖化酶活力的测定承受次碘酸钠法。糖化酶能从淀粉分子非复原性末端开头，分解α-1,4硫代硫酸钠的用量，可对应获得甲醛的量。反响为：I2+2OH-=OI-+I-+H2OHCHO+OI-+OH-=HCOO-+I-+H2OOI-+I-+2H+=I2+H2OI2+2S2O32-=S4O62-+2I-KmVmaxS 1

Km 1 1

v Vmax

Vmax方程 ，两边取倒数得公式：

，此式即为1 1vS作图即得一条直线，直线的1/Vmax1/v=01/〔S〕的截距为-1/Km。即依据直线在横轴上的截距(-1/KmKm。胶,明胶是一种多肽聚合物,在肯定pH条件下,带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物,同时海藻酸钠与钙离子在肯定条件下结合形成不溶于水的微球从水中分别出来。戊二醛含有二个醛基,可与蛋白质中的氨基、酚基、巯基发生Schiff形成聚合物已将绝大局部游离酶包埋起来,因此这种交联主要发生在明胶与戊二使用时间延长、机械强度增大、稳定性提高的效果。三、试验试剂与仪器试验试剂100mL。钠溶液等体积混合。36g100mL12.7g，D0.1mol/L4gNaOH1000mL。E1mol/L56mL浓硫酸〔1.84F0.025mol/L硫代硫酸钠溶液：称取硫代硫酸钠〔Na2S2O3`5H2O)6.25g，碳80mL沸试验仪器20mL，6试管，烧杯，容量瓶，玻璃棒，温度计，三角瓶，水浴锅，分光光度计，天平，枯燥箱，生化培育箱。四、试验方案酶活测定401mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。A2%10mL，参加pH4.65mL40℃10min。B参加酶液1m〔空白试验以煮沸失活的酶液代替4010min。反响完毕时，马上于沸水浴中加热使酶失活。0.1mol/L5mL0.1mol/L氢氧15min2mol/L2mL。A以及空白滴定所消耗的硫E1mg葡萄糖的酶1个酶活力单位，即：式中：A--加酶液组平均消耗的硫代硫酸钠溶液的量B--空白组消耗的硫代硫酸钠溶液的量N--硫代硫酸钠溶液的当量浓度90.05--1ml硫代硫酸钠标准溶液(1mol/L)相当的葡萄糖的质量(g/mol)米氏常数的测定52，4，6，8，10mL〔10mL10mL内测定酶活。固定化方法3%的明胶150mL10minpH45~10630min。半衰期的测定30min五、试验结果记录至终点消耗体积/mL至终点消耗体积/mL表1：游离酶活力测定记录表空白 122%可溶性淀粉/mL10 1010pH4.6醋酸缓冲液/mL5 55操作4010min酶液/mL1〔灭活酶〕 11操作 灭活上述反响液/mL5550.1mol/L碘液/mL5550.1mol/LNaOH/mL555操作15min2mol/LH2SO4/mL2220.5%淀粉指示剂/滴3330.025mol/LNa2S2O3滴定18.9711.1711.12

1%可溶性淀粉/mL11%可溶性淀粉/mL12243648510蒸馏水/mL86 4 20pH4.6醋酸缓冲液/mL55 5 55酶液/mL11 1 11操作4010min后，100℃灭活上述反响液/mL555550.1mol/L碘液/mL555550.1mol/LNaOH/mL55555操作 摇匀，暗处放置15min2mol/LH2SO4/mL222220.5%淀粉指示剂/滴333330.025mol/LNa2S2O3滴15.7015.1013.3012.6012.25定至终点消耗体积/mL定至终点消耗体积/mL3：游离酶米氏常数空白组测定记录表0.025mol/L0.025mol/L滴定至终点消耗体积/mL118.90219.50319.20418.70519.60游离酶的半衰期测定

4：游离酶的半衰期测定记录表时间/h00.51.01.52.02.5Na2S2O3滴119.24定消耗体积/ml219.20Na2S2O3滴110.7511.9011.2514.8514.5015.00定消耗体积/ml211.3010.9513.6514.9115.3016.304.4.固定化酶的半衰期测定表5：固定化酶酶的半衰期测定记录表时间/h0 0.5 1.0 1.52.02.5Na2S2O3滴119.19定消耗体积/ml219.21Na2S2O3滴116.60 16.79 17.20 17.3017.4017.45定消耗体积/ml216.06 16.72 17.02 17.3017.4017.78六、试验数据处理以及结果分析游离酶的酶活力测定6：游离酶的酶活力测定数据处理表A/mLA/mLA/mL111.17211.1211.14B/mLB/mL(B-A)/mL固体酶酶活力U/g18.977.83338.4433844游离酶米氏常数的测定7：游离酶米氏常数的测定数据处理表12345B/mL18.9019.5019.2018.7019.60A/mL15.7015.1013.3012.6012.25(B-A)/mL3.204.405.906.107.35VU/mL138.3190.2255.0263.7317.7Sg/L0.0020.0040.0060.0080.0101/vmL/U0.007230.005260.003920.003800.003151/SL/g500250166.71251001/S为横坐标，1/v1/v~1/S函数曲线如下：

Km 1 1 0.0000099

10.0024 ，v Vmax

Vmax

故有：Km 0.0000099 ，1

0.0024

K=0.004125g/L。Vmax

Vmax m

B A8B A时间/h00.51.0 1.52.02.5A/ml119.24219.20B/ml110.7511.9011.25 14.8514.5015.00211.3010.9513.65 14.9115.3016.30/mL/mL11.0211.4219.2212.45 14.8814.9015.65( - )/mL8.207.806.774.344.323.57v354.2336.9292.6187.6186.7154.3v/v011.051.211.891.902.30lg(v/v0〕00.0220.0830.2760.2780.361lg(v/v0〕~t函数曲线如下：0.0693k

E0,k为酶的衰减常数( - )/mLB A2.872.442.091.90( - )/mLB A2.872.442.091.901.801.58v116.399.184.777.072.964.2t E因而：t1/2=0.0693/k=1/0.1430=7h4.固定化酶的半衰期测定9：固定化酶半衰期测定数据处理表时间/h00.51.0 1.52.02.5A/ml119.19219.21B/ml116.6016.7917.20 17.3017.4017.45/mL/mL216.0616.3316.7216.7617.02 17.3019.2017.11 17.3017.4017.4017.7817.62v/v011.171.371.511.591.81lg(v/v0〕00.0700.1380.1790.2030.258lg(v/v0〕~t函数曲线如下：0.0693k

E0,k为酶的衰减常数log( )t E因而：t1/2=0.0693/k=1/0.1084=9.2h5.固定化酶活力回收固定化反响中游离酶的总活力的百分数。即：=[(E”·m”)/(E·m)]·100%式中：E”--固定化酶酶活力(U/g)m”--固定化酶总质量(g)E--参加固定化反响的游离酶酶活力(U/g)m为参加固定化反响中游离酶的总质量(g)15mL乳化混合液制得固定化酶，称重〔湿重〕7.5g。海藻酸钠150mL20%×15/315=0.952%≈