柑桔裂皮病类病毒超低温脱毒技术的初步研究

柑桔裂皮病类病毒超低温脱毒技术的初步研究曹庆1易干军2陈金印3丁芳4（1南昌工程学院科研处，江西南昌330099，2广东省农业科学院果树研究所，广东广州510640，3江西农业大学，江西南昌330045，4华中农业大学，湖北武汉430070）摘要：本研究以感染柑桔裂皮病的红江橙、枳壳、香柠檬、红桔、沙田柚为试验材料，对柑桔裂皮病类病毒的超低温脱毒技术进行了研究。初步建立了柑桔组培苗茎尖玻璃化法超低温体系，而且取得了理想的脱毒效果。结果显示：五个品种脱毒率均可达到88.2%以上。关键词：柑桔裂皮病；超低温保存；脱毒StudiesonCitrusExocortisVirioidEliminationbyCryopreservationAbstract:Thisstudyusedinfected‘Hongjiang’sweetorange（CitrusSinensisOsbeck），Poncirus.trifoliata(L.)Raf.，Meyerlemon(CitrusmeyeriY.)，Tangerine(CitrusreticulateBlanco)andShatianpomelo(Citrusgrandis(L.)Osbeck)asmaterial，attemptedtostudytheeliminationofCEVd.Primarilyestablishedthevirus-eliminationtechniqueandthevirus-eliminationratereached88.2%.Keywords：citrusexocortisvirioid；Cryopreservation；virus-elimination中图分类号：S666柑桔裂皮病是由柑桔裂皮病类病毒（citrusexocortisvirioid,CEVd）引起的[1]。柑桔裂皮病严重阻碍了柑桔的高产优质生产，对柑桔产业已造成严重威胁，种植无病毒苗木是防治柑桔裂皮病的根本措施和重要环节[2]。近年来，超低温脱毒技术成为一种植物高效率的脱毒方法。其原理是在特殊保护剂的保护下，利用-196℃超低温条件，破坏含有病毒的植物成熟细胞，而不含病毒的生长点细胞因为有保护剂的保护，可以在一定的条件下恢复生长，从而达到大批量快速脱毒的目的。玻璃化法是超低温保存方法中的一种。玻璃化法以其要求设备简单、材料处理步骤简便、效果和重演性好等优点倍受人们推崇[3,4]。本研究采用玻璃化法对柑桔茎尖进行超低温保存脱除柑桔裂皮病类病毒，以期为柑桔材料与方法1.1试验材料用于试验的材料为通过嫁接感染柑桔裂皮病的红江橙（C.SinensisOsbeck）、沙田柚(C.grandis(L.)Osbeck)、红桔(C.reticulataBlanco)、枳壳(Poncirustrifoliata(L.)Raf)和香柠檬(C.meyeriY.)（毒源来自广东省杨村）。1.2试验方法1.2.1茎段培养：取用感染CEVd的柑桔枝条剪成1.5-2.0cm长的茎段，经常规灭菌后，接于添加不同激素的生芽培养基上，红江橙和沙田柚在添加6-BA0.5mg/L、IBA0.1mg/L、GA30.3mg/L的MT培养基上培养；香柠檬和红桔在添加6-BA0.25mg/L、NAA0.1mg/L、GA30.3mg/L的MT培养基上培养；枳壳在MT培养基上培养。培养温度26℃，光照12h/d，光照强度2000lx条件下进行诱芽培养。20d左右继代一次。1.2.2感病柑桔茎尖玻璃化超低温处理方法本实验以感病香柠檬为材料对柑桔的茎尖玻璃化超低温处理方法进行优化研究。选取在增殖培养基上培养的20～30d的健康植株，切取长约1cm的芽，在MT+0.7M甘油+40mg/L蔗糖预培养培养基上进行预培养，进行不同预培养天数处理（1、2、3、4、5d）。然后，在无菌条件下，用解剖刀将剥取茎尖大小约为2.0～2.5mm，放入1.8mL的冷冻管中。在室温下浸泡于装载液（60%PVS2）中装载，作不同时间处理（0、20、30、40、50min），60%PVS2的成分为：0.15mol/L蔗糖液体培养基与PVS2溶液体积比为40：60，pH调至5.8，并高温灭菌。将装载液移去，在0℃条件下加入PVS2进行脱水作不同时间处理（0、40、50、60、70min）。PVS2的成分为：MT培养基+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖，pH调至5.8，并高温灭菌。茎尖脱水处理之后，换入一次新鲜的PVS2液，然后将冷冻管装在金属套上，套上一根细线，将材料迅速投入液氮（-196℃）中，在液氮中至少停留1h。将保存材料从液氮中取出，快速投入40℃水浴中解冻90s，用1.2mol/L的蔗糖+MT基本培养基洗涤两次，每次10min。转到MT+6BA（1.0mg/L）+GSH（10mg/L）的恢复培养基上暗培养一周，接着转入光下。半个月后统计成活率（茎尖颜色仍为绿色，有部分长芽或长愈伤组织的茎尖占总茎尖数的百分率），三周后统计植株的再生率（芽萌发并继续生长的茎尖占总茎尖数的百分率1.2.3超低温处理后茎尖的嫁接将成活的茎尖进行试管嫁接，将成活部位的芽全部用于嫁接。待茎尖嫁接后的材料长出两片真叶可靠接于大棚中，无毒的大砧木苗上，接后用薄膜袋套上保湿。1.2.4用RT-PCR检测再生植株的脱毒率。参考文献[5]的方法。2.结果与分析2.1柑桔茎尖的超低温保存2.1.1预培养对香柠檬超低温保存结果的影响当预培养1d时，成活率仅为38.1%，随着预培养的时间延长成活率逐渐增加，预培养3d，成活率最高，达到57.1%。3d以后成活率又随之降低，因此，香柠檬最佳预培养时间为3d。图1预培养时间对香柠檬超低温处理后成活率的影响Fig1EffectofDifferentPrecultureTimeinPrecultureMediumontheSurvivalRateofMeyerlemonafterCryopreservation2.1.2预处理时间对香柠檬超低温保存结果的影响本试验结果显示：预培养3d后的香柠檬的芽，剥取茎尖，室温下，装载液（60%PVS2）中预处理30min效果最好，成活率可达到87.5%，当处理时间延长至50min时，成活率降为69.1%。图2装载液（60%PVS2）处理时间对香柠檬超低温处理后成活率的影响Fig2EffectofDifferentTimeofLoadingwith60%PVS2ontheSurvivalRateofMeyerlemonafterCryopreservation2.1.3PVS取在预培养基上培养3d后的芽，剥取茎尖，室温下，60%PVS2装载30min，在0℃下，PVS2处理不同时间，试验结果显示：PVS2处理60min时效果最好，成活率为86.1%。图3PVS2处理时间对香柠檬超低温处理后成活率的影响Fig3EffectofDifferentTimeofTreatmentwithPVS2ontheSurvivalRateofMeyerlemonaftercryopreservation综合以上结果，香柠檬茎尖超低温保存较佳体系是：选取初代培养20～30d的茎段培养的芽（约1cm长），在MT+0.7M甘油+40mg/L蔗糖预培养培养基上预培养3d，在无菌条件下，用解剖刀将剥取大小约为2.0～2.5mm茎尖。室温下，60%PVS2装载30min，然后在0℃下，PVS2处理60min，换一次新鲜的PVS22.1.4其他几个品种或类型的超低温保存后的成活率红江橙、枳壳、沙田柚、红桔采用优化后的超低温体系保存效果较好。表1其他几个柑桔品种或类型茎尖超低温保存后成活率Table1Thesurvivalrateofshoot-tipsbelongingtosomeothercultivarsaftercryopreservation品种或类型茎尖成活率（%）红江橙88.8±4.17枳壳97.2±4.79沙田柚72.7±2.07红桔52.3±6.012.2柑桔茎尖玻璃化法超低温处理后的脱毒率表2柑桔茎尖超低温保存后脱毒率Table2Thevirus-freerateofshoot-tipsaftercryopreservation品种或类型脱毒率（%）红江橙94.4枳壳92.5香柠檬88.2沙田柚95.2红桔89.33.讨论目前，柑桔主要是通过茎尖嫁接来获得无病毒苗木。国内外有许多学者对此进行了研究。Navarro等（1975）首次将茎尖嫁接运用到柑桔上获得了无病毒苗木[6]。蒋元晖、赵学源、宋瑞琳等也报道过茎尖嫁接可以脱除柑橘裂皮病[7-9]。然而，近年来，超低温脱毒技术越来越多的应用到植物的脱毒上面。因其设备要求简单，一个液氮罐就可以处理大量的材料，不占空间，有利于大批材料的脱毒，方便操作且消耗小等特点逐渐被推广，并有望成为一种植物高效率的脱毒方法。1997年，Brison首次超低温技术处理带李子痘病毒的李离体茎尖，获得了50％的健康植株[10]。草莓、香蕉、葡萄等果树上也逐渐报道了用玻璃化法超低温保存获得无病毒植株[11-13]。研究表明，超低温处理的脱毒率与所取茎尖大小无关，茎尖大小只与超低温处理后的成活率相关。经超低温处理后，感染病毒可能性较大的含大液泡和含水丰富的大细胞则会死亡，而那些几乎不受病毒侵染的位于茎尖分生组织顶端的几层细胞质浓度高的小细胞，则可以经液氮处理而存活下来。因此，由这些细胞再生出的植株可以达到脱毒的目的。然而茎尖嫁接对茎尖操作要求高，陈如珠等（1991）研究茎尖嫁接脱毒表明，茎尖嫁接所用茎尖大小十分关键，大则影响脱毒率，小则影响成活率[14]。本研究对感染柑桔裂皮病的柑桔茎尖进行玻璃化法超低温保存，采用较大的茎尖（2～2.5mm），就能达到88.2以上脱毒率，相比茎尖嫁接操作要求更低，且脱毒效果更好。参考文献：[1]SemancikJS,WeathersLG.Exocortisdisease:evidenceforanewspeciesof“infectious”lowmolecularweightRNAinplants[J].NatureNewBiology,1972,(237):242-244.[2]赵学源,蒋元晖,周常勇,等.柑桔无病毒良种库的建立.中国南方果树[J],1997,26(6),18~21[3]SakaiA,KobayashiS,OiyamaI.Cryopreservationofnucellarcellsofnavelorange(Citrussinensissb.var.brasiliensisTanaka)byvitrification.PlantCellReports,1990,9:30~33[4]王君晖,黄纯农.玻璃化法—园艺作物茎尖和分生组织超低温保存的新途径—文献综述.园艺学报[J],1994,21(3):277~282[5]曹庆,易干军,陈金印,等.柑桔裂皮病类病毒RT-PCR检测体系优化分析,南昌工程学院学报[J],2008,27(3),64-66[6]NavarroL,JucurezJ,BallesterJF,etal.Eliminationofsomecitruspathogensproducingpsorosis-likeleafsymptomsbyshoot-tipgraftinginvitro.Proc.8thConfIOCV.IOCVRiverside,1980,162~166[7]蒋元晖，邱拄石，苏维芳，等.利用茎尖嫁接脱毒培养无裂皮病的脐血橙.植物保护学报，1984，10(3)：166[8]赵学源，蒋元晖.我国柑桔栽培品种的裂皮病鉴定和脱除.园艺学报，1986，13（2）：91~94[9]宋瑞琳，吴如健，柯冲.茎尖嫁接脱除柑桔主要病原的研究.植物病理学报,1999，29(3)：275~279[10]BrisonM,BoucaudMT,PierronnetA,etal.Effectofcryopreservationonthesanitarystateofacv.prunusrootstockexperimentallycontaminatedwithPlumPoxPotyvirus.PlantSci[J],1997,123:[11]利用超低温保存方法脱除香蕉束顶病毒的研究.植物遗传资源学