术中冰冻切片联合快速免疫组化在乳腺癌前哨淋巴结微转移检测中的应用

术中冰冻切片联合快速免疫组化在乳腺癌前哨淋巴结微转移检测中的应用

直到1977年，cabanas提出了前哨淋巴结（sln）的概念，许多研究表明，乳腺癌sln能够正确预测腋窝淋巴结的生长状况，并将sln阴性患者排除在腋窝淋巴结的清创中，但sln具有较高的微移率。因此，如何发现sln的微转移，尤其是在操作过程中快速检测sln的微转移，提高sln诊断的准确性。我科于2003年2月至2006年4月对62例乳腺癌患者采取美蓝染色前哨淋巴结活检(SLNB),术中SLN行冰冻切片检查,阴性者再行enhancedpolymerone-stepstaining(EPOS)法快速免疫组化检查,以发现微转移灶,提高SLN诊断准确率。1数据和方法1.1改良根治术组本组研究对象为我科2003年2月至2006年4月收治的女性患者,均符合以下条件,确诊为乳腺癌,临床体检腋窝淋巴结无肿大,年龄30~68岁,平均54岁。大小:T126例,T236例。位置:左侧36例,右侧26例;外上象限40例,外下象限10例,内上象限8例,内下象限4例。手术方式,均行改良根治术。病理类型:浸润性导管癌47例,髓样癌4例,硬癌1例,浸润性小叶癌2例,导管内癌5例,导管内乳头状瘤癌变1例,导管内癌早期浸润1例,黏液腺癌1例。1.2乳腺癌前哨淋巴结的定位和检测1.2.1试剂蓝染料为1%的美蓝,由江苏济川制药公司生产。EPOS法所用CK及常规CK均购自DAKO公司。1.2.2乳腺癌改良根治术麻醉成功后,将2mL美蓝分4点注入肿块表面的皮下,在腋窝下4cm处取一横弧形切口,长约3cm,循胸大肌外缘下方沿蓝染的淋巴管找到距乳腺最近的蓝染的淋巴结,即SLN,立即送检病理,之后完成乳腺癌改良根治术。1.2.3快速免疫组化检查将56例找到的SLN按长轴分成两半,一半行术后石蜡包埋常规连续切片及免疫组化检查并以此结果作为标准,另一半行冰冻切片检查,如为阴性则行EPOS法快速免疫组化检查(将SLN按0.5mm切一片的原则,每枚SLN切约20~25片),具体步骤为:(1)低温下冷冻,切片,厚度4~6μm;(2)收集于聚赖氨酸包被的载玻片上;(3)丙酮固定30s;(4)空气中干燥1min;(5)加入EPOS(CK)试剂,37℃温箱中孵育25min;(6)PBS冲洗15s3次;(7)DAB显微镜下显色;(8)苏木素轻度复染,常规封片。2sln冰激凌切片检查及术后随访本组62例中56例成功行SLNB,成功率达90.3%(56/62),6例未检出SLN者有5例位于内侧象限,共检出SLN82枚,每例1~3枚,平均1.5枚,所有SLN均位于外侧组(LevelⅠ)。56例均行ALND,共检出淋巴结672枚,每例7~18枚,平均12枚。本组56例均行术中SLN冰冻切片检查,共20例发现SLN癌转移,相应腋窝淋巴结有14例发生癌转移,另6例只局限于SLN。36例SLN冰冻切片阴性者,均行EPOS法CK标记快速免疫组化检查,有2例发现微转移,标记结果如图1。术后对36例SLN均行常规连续切片及免疫组化检查,除上述22例SLN阳性以外,又有2例检出微转移。本组未发现跳跃性转移现象。SLN术中冰冻切片与联合术中EPOS法快速免疫组化结果的比较见表1(按美国Louisville大学提出的评估表准计算)。3讨论3.1美蓝染色法主要有三种:(1)蓝染法。常用染料有异硫蓝、专利蓝及美蓝。(2)放射性同位素标记法。(3)两种方法联用。国内刘国津等报道采用专利蓝SLN的检出率为91%,Weaver等认为SLN的放射示踪法或活性蓝示踪法单用均可造成遗漏,理论上两法合用可提高SLN的检出率。本组采用美蓝染色法,SLN检出率达90.3%,与国内报道相仿,稍低于采用专利蓝或异硫蓝染色。但美蓝具有便宜、无副作用及没有放射性同位素标记法的污染等特点,特别适合国内基层医院使用。但相对于专利蓝或异硫蓝,美蓝的淋巴管亲和力弱,因此手术在解剖并寻找蓝染的淋巴管时,一定要防止出血以保持手术野的清晰。Nason等研究认为SLN的检测成功与肿瘤大小、术前化疗或术前活检无明显关系,主要与SLNB操作技术熟练与否有重要关系,我们亦有同感,本组早期SLN检出率较低,后期检出率明显增高。国内刘君等认为SLN检出率与肿瘤部位有关,肿瘤位于内侧象限时,SLN检出率降低。本组6例未检出SLN者,5例位于内侧象限,我们认为内侧象限肿瘤淋巴引流可能走向内乳淋巴结,因此SLN的检出率低。3.2sln的假阴性问题国内刘国津等报道SLN预测腋淋巴结准确率为96.7%,McMaster等统计了部分研究者的实验数据,SLN准确性为98%。本组SLN预测腋窝淋巴结的准确性达100%,其中16例SLN阳性病例中,有6例SLN是唯一转移的淋巴结,表明SLN是腋窝最早发生转移的淋巴结,为以SLND代替ALND提供了理论和实践依据。但是,如何发现SLN微转移灶,减少假阴性问题,是困扰SLNB技术在临床推广的重要因素。所谓微转移是指常规单水平组织切片未检出的转移灶,一般指转移灶小于2mm或单个细胞转移。国内报道假阴性率在7.6%~13.3%,Turner等报道假阴性率在9.5%~14.3%,McMaster等统计了部分研究者的实验数据,假阴性率为6.2%。因此国内外学者为防止SLN假阴性问题,术后采取SLN连续切片(serialsection)及免疫组化法检查其微转移灶(micrometastases),使SLN预测腋淋巴结的准确性得到了提高,使SLN的阳性发现率由32%上升到42%、Liu等指出采用连续切片及免疫组化法使SLN的微转移检出率达19%,邬一军等报道采用RT-PCR法使SLN的阳性率提高到37.5%。SLN的病理检查结果将决定下一步手术是否有必要进行ALND,因此,在术中必须对SLN进行快速、准确的病理检查,术中冰冻切片检查假阴性率较高,而连续切片及免疫组化染色因费时久都不宜在术中采用,因此如何在术中快速病理诊断SLN,许多作者作出了尝试。Creager等采用术中冰冻切片联合标记细胞学法检测乳腺癌SLN,阳性检出率提高,但仍不能解决SLN的微转移问题。本组采取术中冰冻切片联合EPOS法快速免疫组化检查使SLN微转移的检出率增加,假阴性率由16.7%降至8.3%,具有明显的临床意义,国内王永胜等、国外Nahrig等也有类似报道。同时我们也认识到发现微转移的能力与切片厚度有关,因此,我们适当增加了快速免疫组化的切片数量,每隔0.5mm切1片,效果明显。因此,我们认为EPOS能提高术中SLN病理诊断的准确性,省时,快速,所有操作在30min内完成,不影响下一步手术的进行,值得临床推广。3.3乳腺癌前哨淋巴结活检SLN能准确预测腋窝淋巴结的组织学状况,已得到临床上的广泛赞同,因此,对于SLN为阴性者,则不行ALND,国内外许多学者已经将此理论应用到临床上,短期效果较好。Roumen等报道100例随访2年只有1例发生腋窝复发,王永胜等报道47例随访8个月,未发生腋窝淋巴结复发。但是如何解决SLN的微转移问题,特别是SLN的微转移是否会影响乳腺癌的分期和预后,亦要作前瞻性研究,美国临床肿瘤学会(ASCO)在有关前哨淋巴结