酿酒酵母ap合成关键酶基因的克隆及超表达质粒的构建

酿酒酵母ap合成关键酶基因的克隆及超表达质粒的构建

apol是生物中重要的能量补充材料，是生命活动所需能量的直接来源。它作为一种生化药物,在临床上对癌症、进行性肌肉萎缩、中风后遗症、心肌炎、冠状动脉硬化及肝炎等病症具有一定的辅助治疗作用。目前国内多以腺苷为底物利用酵母菌发酵生产ATP,生产水平远低于日本以腺嘌呤为底物通过产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)发酵生产ATP的工艺。采用毛霉菌(Mucor)从腺嘌呤合成ATP的工艺之前已有报道,毛霉菌具有丰富的酶系,通过它合成ATP具有菌体生长迅速、便于收集、工艺简单和反应时间短等优点,但该工艺存在ATP产量较低,腺嘌呤转化不彻底的问题,如何解决这两点是该工艺能否产业化的关键。课题组对以雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)从腺嘌呤合成ATP的工艺进行了实验,使ATP的产量及转化率有了较大提高,但仍未达到理想水平,尤其是当腺嘌呤投加量增加时,腺嘌呤到ATP的转化率呈下降趋势。要解决这一问题,必须强化该菌的磷酸化能力。酿酒酵母有强大的氧化磷酸化系统,其腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)是嘌呤补救途径的关键酶,可在5’-磷酸核糖焦磷酸(5’-phosphorylribose-1-pyrophosphate,PRPP)作为核糖5’-磷酸供体的情况下,催化腺嘌呤生成核苷一磷酸(AMP),再进一步磷酸化生成ATP。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)有2个独立的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(APT1和APT2),分别编码APRT的2个异构体APRT1和APRT2。而遗传学分析显示,只有APT1能编码有完全活性的酶。实验以1株能从腺嘌呤合成ATP的雅致放射毛霉为出发菌株,PCR扩增得到酿酒酵母APT1基因,并将其克隆至质粒pCB1004-Pgpd的相应位点,得到有强启动子Pgpd驱动的APT1基因超表达质粒pCB1004-Pgpd-APT1,转化雅致放射毛霉,构建ATP高产工程菌。实验考察了酿酒酵母APT1基因在雅致放射毛霉中的克隆表达,对丝状真菌外源基因克隆表达研究具有一定的借鉴作用。1材料和方法1.1材料和培养基菌种和质粒:雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)ZGB1,实验室筛选得到;酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)WH、E.coliDH5α,实验室保藏;质粒pCB1004-Pgpd,由朱廷恒老师赠送;pMD19-Tsimplevector,购于Takara公司。主要试剂:TakaraRNAisoPlus,TakaraOneStepRNAPCRKit(AMV),T4-DNALigase,RNase,氨苄青霉素,氯霉素,潮霉素B,孟加拉红。高渗缓冲液(mol/L):山梨醇1.0,Tris10,pH7.0。转化缓冲液(mol/L):山梨醇1.0,Tris10,CaCl220,pH7.0。种子培养基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,酵母膏5,NaCl5,pH6.0～6.2。菌体培养基(g/L):葡萄糖40,酵母膏3,玉米浆10,NH4Cl3,MgSO4·7H2O1,FeSO4·7H2O0.2,K2HPO4·3H2O3,pH6.0～6.5。再生培养基:以高渗缓冲液配制的种子培养基1.2实验方法1.2.1apt1基因缺失点的设计及合成因为质粒pCB1004-Pgpd在NotI/BamHI位点有强启动子Pgpd,所以对NCBI报道的酿酒酵母APT1序列进行酶切位点分析后,选取质粒BamHI/ApaI位点作为APT1基因的插入位点。然后设计特异性引物APT-F/APT-R,并引入BamHI/ApaI酶切位点(引物由生工生物工程上海有限公司合成)。APT-F:5’-CGCG/GATCCTCGATGTCTATAGCAAGTTATG-3’(BamHI)APT-R:5’-GTGGGCC/CTCATTTTTTCAACGCTTCCTTTT-3’(ApaI)氯化苄法提取酿酒酵母总DNA,PCR扩增APT1基因,T/A克隆至pMD19-Tsimplevector,测序由生工生物工程(上海)有限公司完成,双酶切回收目的片段备用。1.2.2pge-pgpd-apt1的构建如图1所示,PCR扩增得到酿酒酵母APT1基因,并将其克隆至质粒pCB1004-Pgpd的BamHI/ApaI位点,构建强启动子Pgpd驱动的APT1超表达质粒pCB1004-Pgpd-APT1。超表达质粒转化E.coliDH5α感受态细胞,质粒小提后进行双酶切鉴定。1.2.3kpni酶切质粒的制备将制备好的原生质体离心,弃上清液,以冰冷的转化缓冲液洗涤2次并重悬。在100μL原生质体(1×106)悬液中,加入10μL(约1～10μg)线性化超表达质粒(KpnI酶切),冰浴30min;加入20μLPEG-4000含量为60%的转化缓冲液,冰浴10min;再加入370μLPEG-4000含量为60%的转化缓冲液,室温放置10min;再加入1mL再生培养基,28℃,100r/min摇床培养12h;混于含抗生素的选择性培养基并倒平板,28℃培养6～8d,筛选转化子。1.2.4化合物3合成op-4-吡啶二氢化挑取的转化子经种子培养、菌体培养后收集菌体,65℃干燥3h,即为有转化活性的菌体。反应体系(g/L):葡萄糖120,Na2HPO4·12H2O90,MgCl2·6H2O4,腺嘌呤5,菌体100。配好反应体系后搅拌均匀,于33℃,160r/min摇床反应。反应6h开始,每隔2h取样检测产量,16h终止反应。ATP分析测定,采用高效液相色谱法(HPLC)进行。流动相:KH2PO46.8g/L,NaOH1.16g/L。流速:1mL/min。色谱柱:NovaPakC184μm。检测波长:260nm。以峰面积为横坐标,ATP浓度为纵坐标作标准曲线,得到回归方程:Y=0.0585X+0.0185,R2=0.9991。ATP浓度为10～50mg/L时,线性良好。1.2.5pcr确定高产转化子氯化苄法提取转化子及出发菌株的总DNA,分别以特异性引物APT-F/APT-R进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.6转化子抗性检测将筛选得到的ATP高产转化子,在非选择压力下连续传代10次,测其ATP产量并计算摩尔转化率,然后转接抗性平板检测其抗性水平,考察转化子遗传稳定性。1.2.7rnapcroptimizedraq按TakaraRNAisoPlus试剂盒说明书提取转化子及出发菌株总RNA,用TakaraOneStepRNAPCRKit(AMV)进行RT-PCR反应,检测APT1在雅致放射毛霉中的转录水平。RT-PCR体系:10×OneStepRNAPCRBuffer5μL;MgCl2(25mmol/L)10μL;dNTPMixture5μL;RNaseInhibitor(40U/μL)1μL;AMVRtaseXL(5U/μL)1μL;AMV-OptimizedTaq(5U/μL)1μL;APT-F(20μmol/L)1μL;APT-R(20μmol/L)1μL;ToalRNA4μL;RNaseFreeddH2O21μL。反应程序:50℃30min(RT反应);94℃2min(RTase失活);94℃45s,52℃1min,72℃45s(30次循环);72℃5min;4℃保存。2结果2.1受潮霉素b种子培养基培养因为要以潮霉素B抗性为标记进行转化子的筛选,所以转化前,首先要确定潮霉素B对雅致放射毛霉的最小抑制浓度。毛霉目一般对潮霉素B敏感性较低,为了准确高效地筛选转化子,可以通过加入孟加拉红来抑制菌丝的生长及提高其对潮霉素B的敏感性。将雅致放射毛霉孢子,接种于含有100μg/mL孟加拉红及不同浓度潮霉素B的种子培养基平板,以普通种子培养基为对照。28℃培养4d后,对照组雅致放射毛霉长势旺盛,菌丝布满整个平皿,菌丝顶盖生长;潮霉素B为300μg/mL的平板只有零星的菌落,且长势极为矮小;潮霉素B为350μg/mL的平板则完全不能生长。以上结果说明,在含有100μg/mL的孟加拉红的种子培养基中,潮霉素B浓度为350μg/mL时已能完全抑制雅致放射毛霉的生长,为体现严密性实验选用400μg/mL的浓度进行转化子的筛选。2.2细胞系统表达纯化如图2所示,以特异性引物APT-F/APT-R从酿酒酵母PCR扩增APT1基因,目的条带位于500～750bp处。回收目的条带,T/A克隆至pMD19-Tsimplevector,转化E.coliDH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选获得转化子,测序由生工生物工程(上海)有限公司完成。DNA测序结果表明,APT1序列全长564bp,且Blast比对显示与NCBI报道的序列完全一致。2.3apt1和t20如图3所示,超表达质粒pCB1004-Pgpd-APT1双酶切后,得到大小两个片段,其中小片段在500～750bp之间,与APT1大小相符。以上结果说明,超表达质粒pCB1004-Pgpd-APT1构建成功。2.4apt1基因回复突变株的筛选和分子鉴定转化培养后及时挑取长出的单菌落,转接含有600μg/mL潮霉素B及100μg/mL孟加拉红的种子培养基平板,28℃培养进行复筛,长出的抗性菌落可初步认为是转化子。因APT1基因在雅致放射毛霉DNA上的整合具有随机性,其整合方式及位置不同,则造成的影响不同,所以要通过ATP产量测定,筛选出ATP高产菌株。实验从90多株转化子中,筛选得到7株ATP产量高于出发菌株的高产株,如图4所示,其中3号转化子产量最高,当腺嘌呤投加量为5g/L时,ATP最高产量为18.02g/L,摩尔转化率为88.38%,相比出发菌株(ATP产量12.51g/L,摩尔转化率61.35%)产量提高约44.04%。2.5pcr扩增提取3号转化子及出发菌株总DNA,以hph及APT1基因的特异性引物hph-F/hph-R(hph-F:5’-TAGGATCCATGCCTGAACTCACCGCGAC-3’;hph-R:5’-GCGAATTCCCGGTCGGCATCTACTCTAT-3’)、APT-F/APT-R进行PCR扩增,结果如图5所示,转化子出现hph(1019bp)及APT1(564bp)特异性条带,而出发菌株则没有。说明APT1基因已经导入雅致放射毛霉,并整合到其染色体DNA上。2.6潮霉素b、c、ml拉克氏原螯虾g/ml、拉加尔将3号转化子在非选择压力下连续传代10次,测其ATP产量及摩尔转化率,发现无明显降低。将其转接到含有400μg/mL潮霉素B及100μg/mL孟加拉红的抗性平板,发现仍能较好的生长,而出发菌株却不能生长。以上结果说明,APT1基因已在雅致放射毛霉中实现稳定遗传。2.7rt-pcr检测分别提取3号转化子及出发菌株总RNA(如图6A所示),进行RT-PCR检测。RT-PCR结果如图6B所示,转化子出现APT1基因的特异条带,而出发菌株则没有,说明APT1基因已在雅致放射毛霉中实现正常转录。3生长、转化与培养雅致放射毛霉本身具有从腺嘌呤合成ATP的能力,在腺嘌呤浓度较低时ATP产量及摩尔转化率较高;随着腺嘌呤浓度增加,ATP产量虽然也增加,但其摩尔转化率却呈下降趋势。酿酒酵母具有强大的氧化磷酸化系统,其腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)可催化腺嘌呤生成核苷一磷酸(AMP),再进一步磷酸化生成ATP。通过PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法,将酿酒酵母腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因APT1导入雅致放射毛霉,强化雅致放射毛霉AMP合成能力,从而进一步实现提高ATP产量的目的。丝状真菌遗传转化可分为复制型转化和整合型转化,复制型转化只在少数丝状真菌中取得成功,现在实现转化的丝状真菌绝大多数为整合型转化,复制型转化往往会出现质粒丢失的现象,而整合型转化则不会。整合型转化是将质粒线性化处理后转化受体细胞,使外源基因整合到受体细胞染色体DNA上,成为受体细胞染色体DNA的一部分,随染色体的复制而复制。整合型转化具有随机性,会产生大量不同类型的转化子。所以要从大量的转化子中筛选正效应菌株。实验从90多株转化子中,筛选得到7株ATP产量高于出发菌株的高产株,其中3号转化子产量及转化率最高,分别为18.02g/L和88.38%,比出发菌株提高44.04%(在ATP产量测定时发现,HPLC测定值要略大于纸电泳法测定值,分析原因可能是纸电泳法测定时,剪取斑点及浸提等环节存在误差所致)。转化子的筛选过程中往往会出现假阳性,假阳性转化子产量不稳定,很容易干扰实验,所以要进行转化子的遗传稳定性检测。将3号转化子在非选择压力下连续传