腺嘌呤合成腺苷甲硫氨酸高产菌株的克隆与原生质体内的获得

腺嘌呤合成腺苷甲硫氨酸高产菌株的克隆与原生质体内的获得

s-liszhi-l-a族硫酸（sam）是一种由有机4价硫酸组成的磺酸，因此被称为“活性甲基硫酸”，这结构于1952年由cotoi确定。在生物体内,SAM是一种重要的中间代谢产物,除了作为主要的甲基供体,还可以作为转硫基、转氨基、转氨丙基和转核糖基的作用。此外SAM同时也可以通过转硫基作用生成谷胱甘肽(GSH)。临床上,SAM对于治疗抑郁症、骨关节炎、阿尔茨海默氏病等有一定的作用。目前酵母菌是SAM生物合成的主要研究菌株,如强化毕氏酵母过表达腺苷甲硫氨酸合成酶来增加SAM的合成及利用紫外诱变技术获得亮氨酸缺陷型的清酒酵母过表达酿酒酵母中腺苷甲硫氨酸合成酶来增加SAM的产量。国内外采用毛霉菌合成SAM的研究较为少见,用腺嘌呤生物合成SAM的研究尚未见报道。毛霉菌具有生长迅速,便于收集和工艺简单等优点,且采用毛霉菌利用腺嘌呤合成ATP的工艺已有报道,ATP为SAM的合成前体物,并且为SAM的合成提供能量。实验以1株具有转化腺嘌呤生产ATP能力的雅致放射毛霉为出发菌株,构建含酿酒酵母腺苷甲硫氨酸合成酶的重组质粒,转化至雅致放射毛霉原生质体,构建了SAM工程菌,通过合成SAM的实验,筛选得到1株以腺嘌呤为前体物的生物合成SAM的高产工程菌。1材料和方法1.1实验材料1.1.1微生物菌种保藏雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)ZGB1,E.coliDH5α为浙江工业大学微生物实验室保藏;酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae1964),购于中国工业微生物菌种保藏管理中心;质粒pCB1004-Pgpd由浙江工业大学生物与环境工程学院朱廷恒老师馈赠;pMD19-Tsimplevector,购于Takara公司。1.1.2分子试剂和试药蜗牛酶(BR)、纤维素酶(BR),购于蓝堡化学试剂有限公司;KpnI、BamHI等限制酶、核酸Marker等所有分子试剂,购于Takara公司;孟加拉红,购于生工生物工程(上海)有限公司;潮霉素B,购于上海宝曼生物科技有限公司;氯仿、异丙醇、乙醇等其他常用试剂,国产生化或分析纯试剂。1.1.3培养基的制备高渗缓冲液(mol/L):山梨醇1.0,Tris0.01,pH7.0;转化缓冲液(mol/L):山梨醇1.0,Tris0.01,CaCl20.025,pH7.0;原生质体酶解液:纤维素酶2.0%、蜗牛酶0.5%的高渗缓冲液;种子液体培养基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,酵母膏5,NaCl5,pH6.0~6.2;种子固体培养基:种子液体培养基中加入2%的琼脂;菌体培养基(g/L):葡萄糖40,酵母膏3,玉米浆10,NH4Cl3,MgSO4·7H2O1,FeSO4·7H2O0.2,K2HPO4·3H2O3,pH6.0~6.5;固体再生培养基:以高渗缓冲液配制的种子固体培养基;固体抗性培养基:种子固体培养基含潮霉素B400μg/mL,孟加拉红100μg/mL;SAM合成反应体系(g/L):葡萄糖80,K2HPO4·12H2O70,MgSO4·7H2O4,腺嘌呤3,甲硫氨酸4。1.2实验方法1.2.1启动子pgpd扩增质粒pCB1004-Pgpd在Not/BamHI位点处已连接构巢曲霉甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的强启动子Pgpd,因此将目的基因克隆至该启动子下游多克隆位点,可以强化目的基因在宿主菌中的表达。另外该质粒同时含有潮霉素抗性基因hyg和氯霉素抗性基因cat,可以用于转化子的筛选和验证。用Primerpremier软件对NCBI报道的酿酒酵母sam2基因以及质粒pCB1004-Pgpd的启动子Pgpd下游多克隆位点和潮霉素抗性基因hyg序列进行引物设计,引物序列见表1。氯化苄法提取酿酒酵母总DNA,PCR扩增sam2基因,T/A克隆至pMD19-Tsimplevector,验证后测序由生工生物工程(上海)有限公司完成,双酶切回收目的片段备用。1.2.2重组质粒的构建如图1所示,PCR扩增出酿酒酵母中的sam2基因,通过对载体与目的片段的BamHI/KpnI的双酶切,经过T4ligase连接后,构建重组质粒pCB1004-Pgpd-sam2,重组质粒转化E.coliDH5α感受态细胞,提取质粒进行双酶切鉴定。1.2.3重组质粒pc2004-pgpd-sm2的光催化作用培养转导剂在种子液体培养基中,28℃萌发4h后的毛霉孢子,加入原生质体酶解液在30℃酶解处理2.5~3h,获得毛霉原生质体。在100μL原生质体(1×106)悬液中,加入10μL(约1~10μg)线性化处理后的重组质粒pCB1004-Pgpd-sam2(KpnI酶切),冰浴30min;加入25μLPEG-4000含量为60%的转化缓冲液,冰浴10min;再加入500μLPEG-4000含量为60%的转化缓冲液,室温放置10min。转化液加入1mL转化缓冲液稀释后混合于15mL冷却至60℃左右的固体再生培养基(含潮霉素B400μg/mL,孟加拉红100μg/mL),覆盖在固体再生培养平板上,28℃培养6~8d,筛选转化子。挑取固体再生培养平板上长出的单菌落,转接于同样的抗性平板进行复筛,初步认为复筛平板上长出的菌落为阳性转化子。1.2.4活性菌体的制备各转化子分别接种斜面,28℃、4d培养得斜面种子;斜面种子接入带玻珠的30mL无菌水三角瓶,160r/min摇床振荡10min,得毛霉孢子悬液;孢子悬液以10%种量接入种子液体培养基,28℃、200r/min摇床培养12h,得液体种子;液体种子以10%种量接入菌体培养基,28℃、200r/min摇床培养12h,得菌体培养液;菌体培养液二层纱布抽滤收集湿菌体,放烘箱65℃干燥2~3h处理,即为活性菌体。合成反应体系中加入活性菌体80g/L搅拌均匀,于37℃,160r/min摇床反应,反应12h终止,测定反应液中SAM产量,筛选SAM高产转化子。SAM产量测定采用高效液相色谱法(HPLC):取反应液1mL,在10000r/min,4℃条件下离心5min,上清液用0.45μm滤膜过滤得色谱检样液。采用InertsilODS-SP柱(5μm,4.6mm×250mm),流动相为15%甲醇-85%缓冲液(含0.6%乙酸铵、0.01%辛烷磺酸钠的水溶液),用甲酸调至pH3.0,流速0.5mL/min,检测波长254。采用外标法以不同SAM浓度标样及其峰面积作标准曲线,得到的回归方程。根据检样中SAM的峰面积,代入回归方程计算检样中的SAM含量。1.2.5潮霉素抑制剂单次给药和hyg基因检测氯化苄法提取毛霉转化子DNA,以特异性引物samF/samR扩增sam2基因,同时以潮霉素特异性引物hygF/hygR扩增hyg基因,1%琼脂糖凝胶电泳验证。1.2.6耐药基因检测转录水平检验根据宝生物公司提供的组织/细胞总RNA提取试剂盒提取毛霉出发菌株和SAM高产转化子的总RNA。使用宝生物公司的PrimeScriptRTreagentKit进行RNA的逆转录,反应体系为:5×PrimeScriptbuffer2μL;oligodTprimer0.5μL;随机引物0.5μL;ddH2O3.5μL;PrimeScriptEnzyme0.5μL;总RNA3μL。逆转录反应程序:37℃15min;85℃5s。获得cDNA后以特异性引物samF/samR扩增sam2基因,1%琼脂糖凝胶电泳验证。翻译水平检验采用提取细胞总蛋白经SDS凝胶电泳验证。电泳样品的制备:将培养获得的菌体经液氮研磨3~5次。菌体粉末溶于PBS缓冲液。菌体经超声破碎仪超声(3s,9s),超声时间为5min。取超声混合液8000r/min离心5min,取上清液,经浓缩离心仪浓缩后加入100μL无菌水悬浮获得总蛋白。取20μL蛋白液加入等体积的2×载样液,沸水浴3min,10000r/min离心3min,取上清液进行电泳。1.2.7体外酶促反应ames转化子经菌体培养收集后,取1g湿菌体经液氮研磨3~5次,磨至细粉状。加入5mL含1mol/LDTT溶液50μL的磷酸钾缓冲液(pH7.9,PBS),漩涡振荡,低温超声破碎菌体,获得菌体内蛋白抽提液,测定其SAM合成酶的活力。体外酶促反应体系1mL中,加入20mmol/L的L-Met,20mmol/L的ATP,8mmol/L的还原型谷胱甘肽,20mmol/L的MgCl2,100mmol/L的KCl及150mmol/L的pH7.4的Tris-HCl和适量的蛋白抽提液,37℃水浴1h,用不加L-Met的反应作为空白对照。反应结束后,加入0.5mL的20%的高氯酸溶液,离心除去沉淀,所得上清液同样采用HPLC测定SAM的含量。酶活定义:37℃,1h催化合成1g的SAM所需的酶量为1U。1.2.8原料代谢产物的测定方法采用筛选获得的SAM高产转化子,在合成SAM过程中,定时检测反应液中主要原料葡萄糖、腺嘌呤和产物SAM含量,初步研究原料消耗和产物形成规律。葡萄糖的测定:采用测定还原糖的DNS法。腺嘌呤的测定:取反应液500μL,加入500μL1mol/LNaOH溶解腺嘌呤,在10000r/min,4℃条件下离心5min,上清液用0.45μm滤膜过滤。测定采用高效液相色谱法(HPLC)。液相方法与SAM相同.SAM的测定:见1.2.4。2结果与分析2.1目的条带的构建氯化苄法提取酿酒酵母基因组,以酿酒酵母基因组为模板,特异性引物samF/samR扩增sam2基因。PCR产物电泳结果如图2所示,在约1.1~1.2kb处有目的条带。该目的条带通过T-A克隆至pMD19-Tsimplevector,转化感受态大肠杆菌DH5α进行蓝白斑筛选,获得白斑阳性转化子,转化子提取质粒后经BamHI/KpnI双酶切验证,验证正确的转化子由上海生工生物工程公司测序。测序结果表明,目的条带长1155bp,与NCBI上的sam2基因全长相同,且经过BLAST比对,序列完全相同。2.2apai/kpni双酶切电泳结果用sam2基因和质粒pCB1004-Pgpd构建重组质粒pCB1004-Pgpd-sam2后,重组质粒pCB1004-Pgpdsam2用ApaI/KpnI双酶切,经过1%琼脂糖电泳得到两个片段,结果如图3所示。小片段大小约为1.2kb,与sam2基因大小相似,而大片段约为6.9kb,与质粒pCB1004-Pgpd大小相似。结果表明,重组质粒pCB1004-Pgpd-sam2构建成功,可用于后续导入雅致放射毛霉的实验中。2.3抗菌剂的筛选转化培养后及时挑取长出的单菌落,转接含有400μg/mL潮霉素B及100μg/mL孟加拉红的种子固体培养平板,28℃培养进行复筛,长出的抗性菌落初步认为是转化子。通过产物合成反应测定各转化子的SAM产量,从挑取的35株转化子中,获得5株SAM产量高于出发菌株的转化子,见图4,其中1~4号转化子SAM产量最高,产量为1.00g/L,比出发菌株ZGB1的0.40g/L提高了1.5倍。2.4潮霉素hyg基因扩增氯化苄法提取毛霉转化子基因组,以特异性引物samF/samR扩增sam2基因,同时以潮霉素特异性引物hygF/hygR扩增潮霉素hyg基因,扩增结果如图5所示,sam2扩增的结果在1.1~1.2kb处有目的条带,且与pCB1004-Pgpd-sam2质粒PCR扩增的sam2基因大小相同。而扩增hyg在1kb处则有一目的条带,与NCBI上的hyg基因大小相似。2.5pcr检测sa大鼠体内zbc1的转录水平分别提取转化子及出发菌株总RNA,进行逆转录,合成cDNA,后用特异性引物samF/samR扩增的产物电泳结果如图6所示。转化子sam2PCR结果在1.1kb处有1条条带,与质粒pCB1004-Pgpd-sam2为模板扩增出的sam2目的片段大小相似,而以出发菌株ZGB1逆转录合成cDNAPCR结果则在1.1kb处无目的片段。说明酿酒酵母sam2基因已在雅致放射毛霉体内进行转录水平的表达。总蛋白经SDS凝胶电泳验证,验证结果如图7所示。图中1泳道在约42kDa处有一较为深黑色条带的目的蛋白片段,而对照2泳道为ZGB1,几乎无目的片段条带,提示sam2基因已在雅致放射毛霉体内进行翻译水平的表达。但sam2基因为Pgpd启动子启动的组成型表达,无任何诱导物进行诱导,因而从图7中目的蛋白条带的宽度看,其在雅致放射毛霉内表达量比通常文献报道的诱导表达量明显要少。2.6菌株的酶活力测定根据1.2.7方法进行SAM合成酶体外酶促的反应,反应1h后终止反应,测定其酶活力。结果如表2所示。与对照菌株ZGB1相比,转化子的SAM酶活提高了约2.8倍。可见由于外源sam2基因整合至雅致放射毛霉菌体,导致重组菌SAM合成酶活力有显著的提高。2.7pa采用糖代谢过氧化系统atp的合成为研究产物合成特性,分别对转化子与出发菌株ZGB1的产物合成过程中的葡萄糖、前体物腺嘌呤及产物SAM进行了测定。结果如图8所示,0~4h时,转化子与出发菌株ZGB1的葡萄糖消耗较大,其可能原因为葡萄糖经菌体内代谢和磷酸化系统合成SAM前体物ATP。作为ATP合成前体物,腺嘌呤于2~8h时大量消耗,腺嘌呤经体内酶促反应生成AMP、ADP,进而生成ATP,因此腺嘌呤利用相对于葡萄糖的利用具有迟缓性。而0~2h,SAM合成产量很少,也与腺嘌呤消耗较少有关,2~8h时与腺嘌呤相对应的,其SAM大量合成而在胞外快速积累。8~12h,葡萄糖残留浓度太低而基本不消耗,与之对应腺嘌呤消耗也较少,而SAM合成也减缓,这为后续合成工艺的改进提供了重要指导。与出发菌株ZGB1相比,转化子葡萄糖与腺嘌呤的利用率更高,SAM合成量提高了1.5倍。3制备成酶菌株的筛选与活性目前,国内外大多是利用酵母菌和大肠杆菌进行S-腺苷甲硫氨酸的生物合成,主要方法包括对菌株的传统育种和培养条件的优化,或者是通过遗传工程来改造菌株,而利用丝状真菌进行研究及生产SAM尚未见报道。杨善岩等在雅致放射毛霉体内成功表达酿酒酵母腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因APT1,这为酿酒酵母SAM合成酶基因sam2在雅致放射毛霉菌体的克隆与表达提供了借鉴。本文通过PCR技术扩增酿酒酵母的SAM合成酶基因sam2,并成功构建重组载体pCB1004-Pgpd-s