下载本文档
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
hplc-msms法检测牛奶中5种多肽类抗生素
1多肽类抗生素的检测氨基酸多酚是由不同类型的氨基酸结合而成的小分子醇酯。它主要用于促进动物的生长,治疗动物疾病。目前,多肽类抗生素被广泛用于家禽、猪、牛等饲料添加剂和兽药[1~3]。常用的多肽类抗生素包括粘杆菌素、杆菌肽、维吉尼霉素及万古霉素等。然而,随着多肽类抗生素的广泛使用,滥用及不遵守休药期等现象时有发生。药物将可能通过食物链的传递进入人体,危害人体健康。如果长期暴露,还会增加细菌的抗药性,具有潜在的健康风险和生态风险。多肽类抗生素可分别抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、绿脓杆菌、真菌、病毒、螺旋体、原虫的感染,特别是对牛乳腺炎等疾病有较好的疗效。目前,欧盟、日本、美国、澳大利亚等均已制定牛奶中多种多肽类抗生素的限量。其中,欧盟对杆菌肽A及粘杆菌素的限量分别为100和50μg/kg;日本对杆菌肽A、维吉尼霉素、万古霉素、粘杆菌素的限量分别为400,100,10和10μg/kg。而我国也于近年制定了牛奶中杆菌肽A及粘杆菌素的限量,分别为500和50μg/kg。关于多肽类抗生素的检测方法逐渐引起了关注。目前,多肽类抗生素检测方法包括微生物法、免疫分析法、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法等,但这些方法均存在灵敏度低等问题,无法满足粘杆菌素的50μg/kg的检出限要求。有关同时检测这5种多肽的研究尚未见报道。近年来,HPLC-MS/MS检测方法在痕量分析中的应用广泛,已有用HPLC-MS/MS检测多肽的报道。但该方法前处理方法复杂,检出限仍无法满足现有国际限量的要求。本实验采用快速前处理步骤,同时检测牛奶中5种多肽类抗生素,方法简单、实用。2实验部分2.1仪器、仪器和试药1200液相色谱仪(美国Agilent公司);API5000串联四级杆质谱仪(美国AB公司);十万分之一天平(瑞士MettlerToledo公司);高速冷冻离心机(美国Thermo公司);WatersSunfineC18色谱柱(50mm×2.11mm,5μm,美国Agilent公司);旋转蒸发仪(日本Eyela公司);N-EVAPTM111氮吹仪(美国OA公司);KQ-500DB型数控超声波清洗器(中国昆山市超声仪器公司)。乙腈和甲醇(HPLC级,Fisher科技公司);其它试剂为分析纯(上海试剂厂);水为MilliQ超纯水。维吉尼霉素纯度95%、杆菌肽纯度92%、粘杆菌素纯度99%、万古霉素纯度95%(Sigma公司)。2.2实验方法2.2.1%苯甲酸溶液分别称取杆菌肽、粘杆菌素、万古霉素的标准品各0.01g(精确至0.000001g),用0.1%甲酸溶解并定容至100mL;称取维吉尼霉素标准品0.01g(精确至0.000001g),用甲醇溶解并定容至100mL,制得100mg/L的标准储备液,在4℃下背光储存。根据需要,用乙腈-0.2%甲酸(1∶9,V/V)溶液稀释成不同浓度的标准工作液,即用即配。2.2.2%苯甲酸溶液取2mL牛奶,加入10mL甲醇-水-甲酸(28∶72∶0.1,V/V)提取液,1mL4%三氯乙酸乙腈溶液,涡旋3min,超声5min,4℃下以10000r/min离心,取上清液,氮气吹干,用2mL乙腈-0.2%甲酸溶液(1∶9,V/V)溶解。加入5mL正己烷,涡旋混匀,以10000r/min离心5min,弃去正己烷层,重复1次,将下层溶液过0.22μm滤膜后移入进样瓶中,供HPLC-MS/MS分析。2.2.3%v/v苯甲酸-水溶液法采用WatersSunfineC18色谱柱(50mm×2.11mm,5μm);柱温30℃;进样体积5μL。流动相为含0.1%(V/V)甲酸的乙腈溶液(A)和含0.1%(V/V)甲酸-水溶液(B),流速为0.20mL/min,梯度洗脱:0~3min,85%~60%A;3~5min,60%~50%A;5~14min,50%~10%A;14~18min,10%~85%A;18~25min,85%A。电离方式:电喷雾;离子源温度:550℃;雾化气:30L/h,辅助气:40L/h,气帘气:15L/h,入口电压:10V,出口电压:13V;正离子扫描;多反应监测模式,各种多肽类抗生素的采集参数见表1。3结果和讨论3.1丰度的双荷与三荷离子5种多肽类抗生素(万古霉素、粘杆菌素B、粘杆菌素A、杆菌肽A和维吉尼霉素M1)是由氨基酸缩合而成的肽类物质,分子量从525到1448。在进入一级质谱后,容易与一个或多个H+结合,产生带正电的单电荷或多电荷离子。维吉尼霉素是分子量最小的多肽类抗生素,分子量525,与H+结合,产生稳定的准分子离子峰m/z526。而万古霉素、粘杆菌素B、粘杆菌素A和杆菌肽A的分子量均超过1000,在进入一级质谱后,能产生不同丰度的双电荷离子和三电荷离子。选择丰度最大的双电荷离子([M+2H]2+)m/z712.2和725.0分别作为杆菌肽A和万古霉素的母离子。而对于粘杆菌素B和粘杆菌素A,本研究分别比较了在0.1%甲酸水溶液中双电荷离子m/z586、578和三电荷离子m/z391.0、386.0的响应值。三电荷离子([M+3H]3+)的丰度大于双电荷离子([M+2H]2+),所以本研究选择丰度最大的三电荷离子m/z386.0和391.0分别作为粘杆菌素B素和粘杆菌素A的母离子。[M+nH]n+离子作为母离子进入二级质谱后发生断裂或重排等反应产生不同碎片离子。如图1a所示,[M+H]+作为维吉尼霉素的母离子产生有显著丰度的m/z337.2及355.0离子碎片,其中m/z337.2丰度最高,作为定量离子。[M+2H]2+作为杆菌肽A的母离子产生有显著丰度的m/z199.2,253.4,356.2等子离子,选择丰度最大的m/z356.2作为定量离子。其断裂的机理如图1b所示。与之类似,万古霉素的双电荷离子作为母离子产生碎片离子m/z100.3,144.2等子离子,质谱图和断裂方式如图1c所示,选择丰度最大的m/z144.2作为定量离子。粘杆菌素A和粘杆菌素B分子量以三电荷离子m/z391.0和386.0为母离子。但是由于加上3个质子后,化合物裂解产生改变,粘杆菌素A和粘杆菌素B的二级离子质谱图见图1d和1e。3.2%甲醛-乙腈体系由于多肽类抗生素本身带有较多的氨基和羧基,对pH值有严格的要求。实验比较了0.1%甲酸溶液-乙腈、0.1%乙酸溶液-乙腈、5mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸溶液-乙腈对离子化的影响。结果表明,0.1%甲酸-乙腈体系能使多肽类在质谱中有最好的响应值,这是由于甲酸可以为阳离子的形成提供必需的质子来源,从而提高其离子化效率,因此选用甲酸作为酸度调节剂。但是0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相时,粘杆菌素A色谱峰拖尾严重,如图2a所示。由图2b可见,在0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈体系下,甲酸可以使色谱柱内硅胶硅醇基质子化,从而减弱硅醇基与多肽药物之间的相互作用,使得色谱峰型尖锐,且拖尾现象减少。此外,由于多肽本身不稳定,在40℃以上很可能会部分分解,而当柱温低时流动相粘度大,目标物质出峰慢、色谱柱的理论塔板数低,因此柱温选为30℃。3.3不同水-甲醇及溶剂的配比对多肽类抗生素提取效果的影响多肽类物质溶解性差别较大,杆菌肽、粘杆菌素和万古霉素易溶于水,微溶于甲醇等有机试剂。但是维吉尼霉素易溶于甲醇,因此在提取过程中使用含不同配比0.1%甲酸和甲醇作为提取液。添加浓度在100μg/kg下,对比了体积比为5∶5,6∶4,7∶3,8∶2的水-甲醇作为提取液的效果,结果见图3。水-甲醇(7∶3,V/V)的提取效果最好,可达到80%以上。在此基础上对提取液的配比进行了微调,比较了70∶30,72∶28,74∶26和72∶28(V/V)的水-甲醇提取液对4类多肽类抗生素的提取效果,结果表明,水-甲醇(72∶28,V/V)水-甲醇的提取效果最好。因此,本研究的提取液选择水-甲醇(72∶28,V/V)。实验表明,4%,6%和8%(V/V)的三氯乙酸-乙腈溶液除蛋白的效果差别不显著。虽然部分物质存在干扰,但是在提取离子流图中不影响多肽类物质的定性和定量分析。但是8%三氯乙酸-乙腈溶液导致5种多肽类物质特别是粘杆菌素A和粘杆菌素B的峰型变化较大,而4%三氯乙酸-乙腈溶液对峰型的影响较小。因此,本研究选用4%三氯乙酸-乙腈溶液作为除蛋白溶剂。采用正己烷除去牛奶中的脂肪类杂质,对比5mL正己烷除脂两次和10mL正己烷除脂一次的效果发现,5mL正己烷除脂两次的效果好。图4为100μg/kg杆菌肽、粘杆菌素、万古霉素和25μg/kg维吉尼霉素的标准添加色谱图。3.4酸度对多肽类物质稳定性的影响由于多肽类抗生素还有多个氨基和羧基,在不同的酸度条件下呈现不同的形态。而不同形态的多肽类抗生素在质谱中的电离程度差别较大,因此需要合适的酸度环境使多肽类物质有稳定的空间结构。实验发现,以0.1%甲酸-乙腈(1∶9,V/V)作为复溶的溶解液,1h后粘杆菌素的响应值减半,4h后检测不到粘杆菌素A和粘杆菌素B,其它3种多肽类物质可以稳定存在。调节溶解液酸度和有机相比例,发现0.2%甲酸-乙腈(1∶9,V/V)可以使粘杆菌素在8h内保持稳定,此时pH值约为2.5。3.5线性范围和相关系数配制一系列标准工作溶液,做基质标准曲线,5种多肽的线性方程、线性范围和相关系数见表2。以信噪比为3估算检出限(LOD),5种多肽的
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 装修纠纷装饰补充协议范本
- 技术合作合同书
- 高中数学 8.2.3 二项分布(2)教学设计 苏教版选择性必修第二册
- 2024年高中地理 第4章 文明旅游 4.4 旅游安全教案 湘教版选修3
- 2024年八年级生物下册 6.1.2生物对环境的适应和影响教学设计 (新版)济南版
- 2023七年级数学上册 第4章 图形的初步认识4.1 生活中的立体图形教案 (新版)华东师大版
- 2024-2025版高中物理 第四章 电磁感应 5 电磁感应现象的两类情况教案 新人教版选修3-2
- 总部园区基地物业管理合同(2篇)
- 银行防控风险合同(2篇)
- 湘教版福建省福州市八县(市、区)一中2023-2024学年高一上学期11月期中联考数学试题
- 专题03正比例函数和反比例函数(原卷版+解析)
- DL-T956-2017火力发电厂停(备)用热力设备防锈蚀导则
- 护理英语智慧树知到期末考试答案章节答案2024年齐鲁医药学院
- 危险货物道路运输规则第5部分:托运要求(JTT617.5-2018)
- 保密工作流程管理制度
- DZ/T 0462.1-2023 矿产资源“三率”指标要求 第1部分:煤(正式版)
- 全面推进依法治国的总目标和原则教学设计
- 爬爬赛活动策划方案(5篇)
- 银行理财方案设计案例
- 呕血窒息的护理查房
- 计算机应用基础(Windows 10+Office 2019)(第4版)课件 单元2 Windows 10的使用
评论
0/150
提交评论