蛋白多肽类药物非临床药代动力学研究进展

蛋白多肽类药物非临床药代动力学研究进展

蛋白质和养分分子在维持身体的正常功能方面发挥着重要作用。作为一种药物，它具有特异性强、剂量低、功能清晰、副作用少等特点。随着生物技术的发展,已有大量蛋白多肽类药物进入市场。1合成药物的动态特性蛋白多肽类药物在分子结构、理化性质以及作用机理等方面与传统小分子药物都有着本质区别,在生物体内有其自身的药代动力学特点与规律。1.1蛋白质多肽类口服制剂目前,蛋白多肽类药物大都选用非胃肠道途径给药,如iv、sc、im等。有报告指出,鼻腔给药可以促进生物制剂在组织,尤其是脑组织中的特异性分布,一些鼻腔给药的小肽类药物,如黄体生成素释放激素,血管紧张素II等已经上市。蛋白多肽类药物口服制剂的开发一直都是国内外研究的热点。采用脂质体、微粒或纳米粒作为药物载体,可以有效抑制药物酶解和促进药物吸收。最新的研究表明,细胞穿透肽(Cellpenetratingpeptides,CPPs),如HIV-1Tat,PenetratinandOligoar-Ginine,是一种可以促进蛋白质多肽分子肠道吸收的有力工具。例如,Penetratin能够显著提高胰血糖素样肽-1(GLP-1)在回肠粘膜的透过率,可使其口服给药的生物利用度达到5%。1.2tki-amesimb仿真蛋白多肽类药物在体内的分布与其靶向性关系密切。在设计药物时,将药物蛋白序列与靶向分子(如RGD片段等)偶联,可使药物迅速富集到病灶部位,能够显著提高药物疗效和降低药物毒性。近来,有研究者应用噬菌体展示技术(Phagedisplaytechniques)筛选出了具有鼻-脑归位功能的多肽片段,并将获得的归位肽作为一种新型靶向分子应用于药物的脑内投递。与小分子药物相比,蛋白多肽类药物的表观分布容积(Vd)通常较小,组织药物浓度与血药浓度的比值约为1%~10%,脑组织中更低约0.1%。本课题组开发的一类新药抗肿瘤多肽mPEG-SC20k-HM-3,在SD大鼠体内Vd为0.11L/kg,在肝、肾、心、脾、肺及肌肉中药物浓度与血药浓度之比为0.5%~5%。1.3抗cea单克隆抗体在生物体内,小分子药物代谢的主要途径是与肝微粒体中P450酶系发生氧化、还原及结合反应。而蛋白多肽类药物则多是通过与器官组织中的蛋白酶发生水解反应进行降解。此外,这类药物还可通过靶点介导进行消除(Targetmediateddrugdisposition,TMDD),当药物分子与相应配体(受体)结合后,通过胞吞作用进入细胞,随后在溶酶体进行降解。在抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体TMDD的研究中发现,给药7d后,抗CEA单克隆抗体在正常小鼠体内的血药浓度是CEA移植瘤小鼠模型的10倍,这说明抗CEA单克隆抗体在CEA移植瘤小鼠模型的清除率要远高于正常小鼠。蛋白多肽类药物在体内的消除半衰期(T1/2β)一般较短,本课组研发的HM-3(一类抗肿瘤新药,相对分子质量为1820),T1/2β仅为20min左右。对药物蛋白进行PEG修饰、糖基化或Fc融合可以显著延长其T1/2β。如HM-3经PEG修饰后,T1/2β可延长至20h。1.4用于内源性物质的重新合成蛋白质多肽分子在体内代谢降解后,产生的氨基酸及小肽片段大多会进入内源氨基酸库,用于内源性物质的重新合成。除少数多肽外,这些药物很少以原型药的形式排泄。本课题组开发的另一多肽药物AP25(一类新药,相对分子质量为2525.9),经检测在胆汁、尿液、粪便中36h的累积排泄量均小于给药量的0.1%。1.5其他1.5.1线性药代动力学特征蛋白多肽类药物的吸收、转运、消除均可能涉及与体内受体的结合,当药物浓度过高时,药物分子在体内将可能呈现出非线性药代动力学特征。猕猴静脉推注低、中、高剂量重组单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(rh-sc-uPA)后,T1/2β分别为(613±118)min,(1115±211)min和(1213±219)min,AUC与iv剂量无线性关系,CLS随剂量增加而变慢,表明高剂量下该药物在体内不遵循简单的一级动力学过程。1.5.2影响药物代谢的因素药物血浆蛋白结合率是药物与血浆蛋白结合的量占药物总浓度的百分率,是药物代谢动力学的重要参数之一。它影响药物在体内的分布、代谢与排泄,并与药物的相互作用密切相关。与传统药物相比,蛋白多肽类药物的血浆蛋白结合率通常较高,本课题组研发的HM-3与AP25的蛋白结合率均在70%以上。2代谢和泄漏规律药物代谢动力学是定量研究药物在机体内的吸收、分布、代谢和排泄规律的一门学科。目前,在动物体内蛋白多肽类药物的分析方法包括:酶联免疫吸附测定、放射性同位素示踪、LC-MS/MS以及活体成像等。2.1在间接法检测中的应用酶联免疫吸附测定(ELISA)是目前蛋白多肽类药物药代动力学评价的主要方法。该方法以抗体-抗原特异性结合反应为基础,具有灵敏度高、重复性好、操作简便、适用范围广等优点。根据欧洲药品评估局(EMEA)2007版的指导原则,免疫分析技术是唯一被认可的,可用于蛋白多肽类药物临床药代动力学研究的分析技术。ELISA法具有多种检测模式,可用于分析多种空间结构的蛋白质多肽分子。Ding等采用双抗夹心法对含有多个表面结合位点的人脑钠肽与人血清白蛋白融合蛋白(HAS-(BNP)2在大鼠体内的药代动力学进行评价,抗BNP单克隆抗体和抗HAS多克隆抗体的双重识别,可显著降低内源性物质与药物代谢片段的干扰。对于只具有单个结合位点的小分子多肽,可采用间接法进行检测。陈淑莲等建立了生物素-亲合素间接ELISA法,检测血清中游离的β-HCG,灵敏度达0.1ng/mL。李永兵等在间接法的基础上引入竞争机制,建立了间接竞争ELISA法,成功的应用于多肽AP25的临床前药动学研究。间接竞争ELISA法检测AP25,定量限为20ng/mL,回收率为97.98%~101.07%。ELISA法检测的灵敏度取决于信号放大系统,有研究者采用具有强扩增能力的DNA片段来替代标记酶对检测抗体进行标记,通过RT-PCR仪对标记DNA片段进行扩增定量。这种方法将酶反应线性信号放大转变成PCR扩增指数信号放大,可使检测限降低3~4个数量级。生物体内的内源性蛋白与药物代谢片段可能会对ELISA法检测造成干扰。目前,常采用HPLC或LC-MS作为分离手段,对代谢片段与原型药物进行分离,以提高ELISA检测的准确性。Robert等联合ELISA与2DLC/MS对血浆中胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、GLP-1N端、GLP-1C端进行分离与鉴定,准确定量了GLP-1原型药物的血药浓度。2.2示踪剂的选择放射性同位素示踪技术具有灵敏度极高、适用范围广、检测方便等特点,是动物体内药代动力学研究的首选方法。常用的标记核素包括125I,3H等,其中125I因放射性比活性较高,半衰期适宜,标记简单而最为常用。杨婷婷等通过氯胺T法把125I标记到蝎活性多肽ADWX-1分子中的酪氨酸残基上,得到了示踪剂125I-ADWX-1。经放射化学纯度与生物活性检测,显示其放射化学纯度为96.77%,生物学活性未发生明显变化。在药物的检测中,放射性同位素示踪技术常与酸沉淀法、SDS、HPLC联合使用。姜国华等对含有125I-NGF的检测样品进行电泳分离后,进行射线信号检测,获得了125I-NGF在小鼠体内的血药浓度、组织分布、排泄等全部资料。2.3基于质谱分析的分离纯化液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)兼具HPLC高分离性与MS高专属性,不仅能够监测原型药物的浓度,还可同时对药物代谢物进行分析。电喷雾(ESI)和基质辅助激光解析(MALDI)离子源等“软电离源”技术的出现,使质谱可用于分析部分电离性能较强的多肽片段。Liu等建立了监测大鼠体内神经肽片段(45YNWNSFGLRF-NH254)的液-质联用方法。结果分析显示,该神经肽片段在体内消除迅速,片段的主要代谢产物为46NWNSFGLRF-NH254。质谱分析对样品纯度及稳定性要求较高。Alicia等创建了新型在线SPE-HPLC-MS/MS自动化分析系统,能够有效地简化样品的前处理,提高检测效率以及准确性。基于超小颗粒填料(粒径小于2μm)和超高压系统(大于105kPa)的UPLC技术也可为样品的分离纯化提供帮助,采用UPLC-MS技术纯化血浆中抗菌肽(Phylloseptin,PSN-1),回收率达82%以上。2.4imagingphd技术活体成像技术(Livinganimalimagingtechnology)是一类以分子标记与体外显影成像技术为基础的在体实时监测技术,包括核素活体成像与荧光标记技术等。2.4.1对克氏原螯虾肠道吸收的影响核素活体成像技术主要包括正电子发射断层显影技术(PET)和单光子发射断层成像技术(SPECT)。PET与SPECT通过给动物静脉注射少量放射性核素标记的药物,在体外采用特定的检测仪器对射线信号进行收集,从而获得目标分子在体内的实时分布信息。Kamei等以68Ga-DOTA-insulin作为示踪剂,应用PET定量监测了Insulin-CPPs在大鼠体内的肠道吸收与组织分布。结果显示,细胞穿透肽(CPPs)的加入有利于胰岛素在肠道的吸收以及在肾、肝脏中的积累。2.4.2大鼠体内的药代动力学特征荧光标记技术采用荧光素、量子点等对目标物进行标记,不具有放射性。覃光炯等以异硫氰酸标记的牛血清白蛋白作为标记药物(FITC-BSA),建立了同步荧光法考察FITC-BSA在大鼠体内的药代动力学特征。检测过程中激发波长和测定波长同时变化,可有效减少血浆中杂质对FITC-BSA荧光检测的干扰。2.5新技术2.5.1电化学法ECLIA(ElectrochemiluminescenceImmunoassay)是将电化学发光技术与免疫测定相结合,建立的一种新型免疫分析技术,兼具发光分析的高灵敏度和抗原抗体识别的高特异性。该方法以电极表面由电化学引发的异性发光反应作为检测信号,用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab,通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术获得目标物,再根据三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+在电极上的发光强度对Ag-Ab进行定量分析。Lowe等采用该技术对人血清中蓝尼单抗(Ranibizumab)进行了定量分析,检测限达到300pg/mL。采用ECLIA、ELISA和LC-MS/MS分别对PEG修饰的胰岛素进行检测,检测结果显示,三者的检测范围分别为2.09~125,8.52~75,100~1000ng/mL,ECLIA相对于后两者具有更高的灵敏度。2.5.2血管内皮因子微流控芯片免疫分析方法是以微流控芯片技术为基础构建起来的免疫学分析方法,通常采用荧光检测和化学发光检测等光学检测作为测定手段。该方法具有样品用量极少、测定范围广、分析速度快等特点。Lin等在PDMS芯片上用夹心免疫荧光法测定了人血管内皮生长因子,检出限为4pmol/L。GyrosTM免疫测定平台是将微流控免疫测定技术实现小型化和自动化的检测平台。Liu等对GyrosTM技术定量分析人血清中利妥西单抗进行了验证,验证结果显示,GyrosTM具有较好的准确性、精密度以及选择性,灵敏度与ELISA法相当,能够提供动态检测范围更广的纳米级测定。3elisa法和lc-ms/ms法蛋白多肽类药物特殊的理化性质决定了其特有的药代动力学特征。在生物体内,这类药物具有首过效应显著,体内靶向分布、受体介导消除、极少以原型药物形式排泄,血浆蛋白结合率较高等特征。与传统小分子药物相比,蛋白质多肽类药物的药动学分析面临着更多的挑战。该类药物在体内代谢过程中,可与多种物质结合,如受体、抗原、内源性结合蛋白等,如何区分游离药物、代谢片段以及结合药物浓度,目前仍是检测分析的一大难点。酶联免疫吸附测定(ELISA)是目前蛋白多肽类药物药代动力学研究的主要方法。采用ELISA法进行药动学评价时,首要考察的是方法的特异性。考察对象包括药物同源蛋白、血浆蛋白、封闭蛋白等。一般情况下,使用单克隆抗体检测的特异性要远高于使用多克隆抗体。常规方法制备抗体往往需要6~8个月,采用新型噬菌体抗体库技术可将制备时间缩短至1周;放射性同位素示踪技术具有极高的灵敏度,与电泳或HPLC联用后,能够有效的区分示踪药物与放射性代谢片段。该方法在药物组织分布及排泄的研究中具有独特的优势。适当的比活度对于放射性同位素示踪技术的检测至关重要,比活度过低会影响检测灵敏度与准确性,过高则会提高标记成本以及产生辐射效应;LC-MS/MS具有较好的选择性和重复性,并能对药物代谢物进行监测。目前,该方法主要是用于一些结构简单、稳定性较强