蛋白质分子的结构与功能

蛋白质分子的结构与功能

蛋白质是构成生物的重要集合，是形成生物的基本成分。蛋白质的生物活性是由其特定的化学结构和空间结构决定的,化学结构不变,而空间结构破坏导致蛋白质生物学功能的丧失的过程称为蛋白质变性或去折叠。化学结构发生改变才称为蛋白质的化学修饰。有的情况下化学结构改变并不影响蛋白质的生物学活性,这些修饰成为非必需部分的修饰。但是在大多数情况下,蛋白质化学结构的改变将导致生物活性(如下降以至完全丧失)的改变。自20世纪70年代末以来,有关用合成有机物进行蛋白质化学修饰的研究报道越来越多。蛋白质化学修饰的目的是用于生物医学和生物技术方面。在生物医学方面,化学修饰可以降低免疫原性的免疫反应性、抑制免疫球蛋白E的产生等;在生物技术领域,酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效地发挥催化作用,并表现出特异的催化性能。化学修饰是研究蛋白质的结构与功能关系的一种重要手段,也是定向改造蛋白质性质的一种有力工具。1经典技术中的蛋白质功能研究蛋白质侧链基团的化学修饰是一种广泛使用的研究手段,也是一种比较成熟的经典技术,在蛋白质特别是酶的结构与功能研究中,曾经起到过十分重要的作用。蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。1.1烷基化试剂和其它试剂由于巯基具有很强的亲核性,巯基基团一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。烷基化试剂和其它一些卤代酸和卤代酰氨是重要的巯基修饰试剂。这种修饰的优点是容易做到定量定位修饰,可使修饰蛋白的生物活性全部保留,是人们最先研究的特异性修饰。但随着定位诱变的迅速发展,半胱氨酸的侧链基团的化学修饰有被取代的趋势。1.2血红素的共价形成机制非质子化的赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团。氨基的烷基化、利用氰酸盐使氨基甲氨酰化是重要的赖氨酸修饰方法。氨基的化学修饰在蛋白质序列分析中占了极其重要的地位。应用氨基修饰的一个热点是血红素—蛋白质缩微模型的制备,以期望弄清楚蛋白链是怎样调节血红素的性质而产生如此多的活性。有两种制备思路,一是将血红素与多肽配位结合以形成折叠的、非共价结合的自组装低聚物;一是将血红素与多肽共价相连以生成折叠的单体。它们都有一共同特点:C2对称的二聚体,倾向于形成准对称结构的金属蛋白。前一种思路设计出的是一种叫DF1的小四螺旋蛋白,在它内部有一氧合的铁。如Sakamoto等研究了许多四螺旋束蛋白质,它们在电解质溶液中自动折叠以形成血红素结合点,以容纳一个His(组氨酸)二配位的血红素。后一种思路设计出的是一种叫微色素(mimochrome)的夹心化合物,即共价的α-螺旋-血红素-螺旋的三明治结构的化合物。Roberto等通过用计算机制图、现代NMR技术和X光衍射进行了结构分析,表明血红素的两个丙酰基与两条C端和N端都被保护起来的多肽链上的赖氨酸的侧链成键(酰胺键),中心His与血红素中的铁配位,两个螺旋反向平行,并都和血红素平行。这些结构简单的模型比它们的天然对应体易于研究,对于搞清楚血红蛋白等的作用机理以及结构与功能之间的关系很有帮助。1.3羧基衍生物的合成目前应用最普遍的标准方法是用水溶性的碳化二亚胺类特定修饰蛋白质分子的羧基基团,产物一般是酯类或酰胺类,它在比较温和的条件下就可以进行。用甲醇的盐酸溶液也可与羧基发生酯化反应。由于羧基在水溶液中的化学性质使得这类修饰方法很有限。1.4ph值和溶剂的影响另外还有咪唑基、酚和脂肪族羟基和二硫键等的化学修饰。这些修饰反应与大多数有机反应不同的一个重要的特征是反应条件要温和得多,这是防止蛋白质分子变性的一个必要条件。pH值决定了具有潜在反应的能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态,因此是影响化学修饰反应的最重要的条件。另外也要考虑温度、溶剂的影响。在20种构成蛋白质的常见氨基酸中,只有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰,并且反应试剂的专一性不够。为了克服这一缺陷,人们开始使用亲和性标记试剂,这些化合物是具有化学反应性的蛋白质分子的底物或配体的类似物。由于结构的相似性,它们对底物或配体的结合部位具有亲和性和饱和性,显示了高度的位点专一性。2注射胰岛素,以及糖尿病胰岛素是最简单和最广泛应用的蛋白质之一,也是被研究最多的蛋白质。注射胰岛素,可以治疗糖尿病。将化学修饰技术运用于胰岛素是希望获得在医药上有用的胰岛素衍生物,主要包括长效胰岛素、速效胰岛素和口服胰岛素,这些衍生物具有良好的应用前景和潜在的巨大价值。2.1关于b链氨端氨基酸化胰岛素是由A和B两条肽链构成,肽链之间靠两对二硫键(A7-B7,A20-B19)相连接。随着对胰岛素结构研究的深入,人们了解了越来越多链段的信息和相应的功能。如胰岛素B链氨端的八肽是胰岛素分子的结构易变区,具有较强的柔性和易变性。移去B链氨端B1-Phe并不影响胰岛素生物活力,但免疫活力显著下降。不同部位的胰岛素化学修饰物的研究结果表明,胰岛素A链N端甘氨酸(Gly)是影响胰岛素分子与其受体相互诱导契合作用以及活性作用正常发挥的重要部位之一。万柱礼等研究去掉A链N端Al-Gly以及A链N端Al-Gly被不同构型的氨基酸取代后的结构特征,为阐明胰岛素分子与其受体结合相互作用的可能机制提供一些重要的结构信息。他们还研究了B链氨端去二肽(B1-2)羧端去五肽(B26-30)胰岛素。这些胰岛素修饰物的结构信息将为胰岛素结构与功能研究提供结构基础,对解释胰岛素与受体分子的结合相互作用有重要意义。2.2高效胰岛素类似物采用定位诱变(即突变)技术在目标基因的预定位点导入突变,然后在适当的载体系统—宿主细胞中表达经过改变的基团,可以获得主链结构有特定改变的蛋白质分子。为了研究胰岛素结构与功能的关系和改善胰岛素的治疗学性质,人们制备了许多的胰岛素类似物,从临床应用角度出发,人们主要研究和发展速效,长效和高效胰岛素类似物;从基础理论研究角度出发,与胰岛素受体结合部位相关的胰岛素类似物是研究的热点。1-5mol/l时，二聚体或六聚体胰岛素在浓度小于10-9mol/L时,主要以单体形式存在;浓度高于10-5mol/L时则以二聚体或六聚体形式存在。因为胰岛素以单体形式与其受体结合表现其生理功能,因而有人通过在胰岛素二聚体形成面上引入电荷或引入侧链有较大空间位阻酌氨基酸残基阻止胰岛素形成二聚体,得到单体速效胰岛素。2正电荷及糖质分子胰岛素一次注射只有3h左右的降血糖效果。利用蛋白质工程方法向胰岛素分子引入正电荷或消除原有负电荷以升高其等电点(原为pH4.5),使其进入人体组织后迅速形成晶体或无定形沉淀,缓慢溶解成单体或二聚体进入血液,起到长效的作用。3人胰岛素类似物高效胰岛素类似物的研究开展较早。定位突变[B10Asp]类的胰岛素体外活力和受体结合能力提高2倍~5倍,甚至更高。Marki等合成的[A8His]人胰岛素类似物的促葡萄糖氧化能力、脂肪分解作用和与胰岛素抗体的结合能力分别是标准人胰岛素的2.46倍、2.99倍和1.96倍。存在的问题是,它们的体内生物活力和受体结合能力并不像体外那样比天然胰岛素高许多倍。因此有待继续研究。4可溶性胞外结构域的相互影响通过比较定位突变的胰岛素类似物分别与完整胰岛素受体及其可溶性胞外结构域的结合能力可以帮助弄清胰岛素受体结合部位,鉴别出对蛋白质的结构完整性和生物学功能至关重要的结构域或个别氨基酸残基,从而获得有关蛋白质分子结构与功能的信息。5胰岛素受体的免疫原性试验杨士珍等合成了[A8His,A9Arg,A10Pro,A21Ala]等胰岛素类似物,并通过它们的受体结合、小白鼠惊厥反应和抗体结合试验,试图说明A8-10区域对胰岛素受体结合及免疫原性的影响。Derewenda等人对B29-Al交联胰岛素的研究结果表明,由于B29-Al肽链的联结限制了B链羧端的运动,导致胰岛素失活。其它B链羧端的变异胰岛素和修饰胰岛素的研究工作也都证明,B链羧端修饰物在胰岛素发挥生物功能时的重要性。3修饰蛋白在养刑事学药物中的应用化学修饰是一种重要的设计蛋白质的手段。迄今为止,已有一百多种蛋白质被修饰后在临床应用中显示出优良性质,如:物理和热稳定性增强,对酶降解敏感程度的降低,溶解度的增大,在体内循环半衰期、清除时间的增长,免疫原性和抗原性的降低及毒性的减小等。修饰蛋白在肽