动物细胞培养技术的研究进展

动物细胞培养技术的研究进展

组织培养技术是19世纪末的一项原材料技术。近一个世纪,从能维持组织存活到生长出新细胞,从少数组织到各种组织细胞的培养,从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺,组织培养技术已成为生物制品制备以及基因工程等领域必不可少的工具之一。随着生物制品需求的不断增加,动物细胞的培养技术已向着大型化、自动化、精细化的方向发展。本文就近年来动物细胞培养技术有关的微载体、氧供应及无血清培养等问题作一文献回顾。使用微载体培养细胞传统的贴壁依赖性细胞的培养是通过静止或转瓶等培养来获得,操作繁复,且耗费空间及人力。1967年,vanWezel首先提出了“微载体”培养系统,为贴壁依赖性细胞的高产培养提出了一个新概念。经过几十年的研究,微载体培养已广泛地应用于动物细胞的培养,其中尤以Pharmacia生物技术公司生产的微载体(Cytodex、Cytopore和Cytoline等)使用范围最广。微载体培养是细胞在由葡聚糖制成的小球表面成单层生长,通过轻轻搅拌使细胞维持悬浮状态。这种培养较传统的单层细胞培养,面积大大增加。如5mgCytodex1表面积能达到30cm2/ml,而传统的单层细胞培养难以达到如此高的表面积/容积比(佩特里培养皿约为4cm2/ml)。如将这种微载体在流化床式、固定床式反应器中进行培养,则可获得比原来多20~50倍的高密度细胞。另外,这种培养对劳动力的需求下降,1升微载体培养生产的细胞相当于50个转瓶(490cm2/瓶)所生产的细胞,省却了玻璃容器等的清洗和准备工作。而且细胞与培养液的分离简单,一旦搅拌停止,3分钟后细胞即能依靠其重力而沉淀,只要去除上清液,而无须进行离心操作。减少了繁复的操作步骤,降低了污染率。目前,狂犬病毒精制灭活疫苗就是采用Cytodex培养Vero细胞而进行大规模生产的。但是,微载体使用量的增加并不意味着能增加细胞产量。过去有人报道,当DEAE-SephadexA-50微载体超过1—2mg/ml时,毒性增加,细胞产量却未达到比例增长。其毒性表现为3方面,即培养初期的细胞破坏、长延滞期及有限的细胞饱和浓度。对此,Levine认为此毒性可能是由于细胞微环境的过度离子交换所致,因为一般微载体如Cytodex1、Cytodex2,为了便于细胞吸附和生长,其表面都具有特殊的小电荷分子。为了缓解上述毒性反应,Pharmacia生物技术公司又制成Cytodex3,即在微载体的表面覆盖一层胶原蛋白,以更接近机体内环境。这种微载体细胞贴壁、生长快,且能长时间培养。通常,运用微载体培养常需加上轻微的搅拌。搅拌能使微载体处于悬浮状态,利于细胞在其表面充分生长,形成均一的培养环境,也可避免因细胞过分生长而引起的微载体凝集,促进气—液间的气体交换。但如搅拌速度过快,对细胞的剪切力增加,将影响细胞的产量。有人对气液界面气泡对微载体培养的影响进行了研究。发现不论是否带有细胞,微载体极易吸附到气液界面,由于流体动力学的关系,当微载体随着气泡上升时,细胞很容易与微载体分离。大多孔微载体Cytopore的发明,则克服了上述弊端。这种微载体以纤维素为基质,内部有许多网状的相互连通的小孔通向载体表面,细胞在接种后,易于进入微载体内部生长分裂,以避免剪切力或气泡的影响,即使大部分细胞免受机械损伤,又为细胞提供了充分的生长空间。这样就意味着允许供气量及搅拌速度增加,允许使用高浓度的微载体,使表面积进一步增加。Onderwater等报道,使用大多孔微载体培养能表达人类细胞色素P450同功酶的V79细胞,细胞量从接种时的2×105/ml,增加到六天后的1×107/ml。ZhaolieC等用多孔微载体Cytopore培养重组CHO细胞系4B3,最高细胞密度达到8.83×106/ml。胡显文等将Cytopore多孔微载体用于中试规模的反应器,也收到了很好的效果。另外,由聚乙烯和二氧化硅制成的微载体Cytoline,则适用于贴壁依赖性及非贴壁依赖性细胞的流床或灌注培养。虽然这些载体还存在某些不足,如成本高、制作工艺复杂、部分微载体不能重复使用等,但随着新的微载体制作材料的开发及对其结构的设计改进,这种载体的优势日渐显露。HyClone公司生产的CultiSpher-S以明胶为基质而制成,具有表面积大、热稳定性强、耐高压灭菌、易于消化分离细胞等特点,为动物细胞培养带来了更多的方便。培养基氧张力的控制细胞培养的理化环境至关重要,有关乳酸、氨、CO2等对细胞培养的抑制作用报道较多,在此不再赘述,仅就供氧作一些介绍。供氧作为动物细胞培养不可缺少的条件,历来受到重视。Kilbum等早在1968年就报道了鼠LS细胞在控制与不控制氧分压的情况下出现的不同的细胞生长。当不控制培养基氧分压时,气相的氧分压从培养起始的160mmHg,下降到对数生长期的120mmHg。而培养基中的氧分压则从接种后的160mmHg明显下降到140mmHg,接着几乎立即下降,至两天半后进入无氧状态,3.8天后培养基中的氧分压才又开始上升。因此,在延长的无氧期,细胞繁殖受到了限制。接着,作者对培养基的氧分压进行了控制,从1.6mmHg到320mmHg,细胞存活量可达最大,为1.2×106/ml,这比不控制氧分压所获得的高50%,同时发现,最佳的培养基氧分压范围为40~100mmHg。可见,正确的氧气供应是细胞获得高产的重要因素。然而,动物细胞对氧的需求可有很大差异。静止的单层细胞培养常处于相对无氧状态,许多建株细胞系(establishedcelllines)的培养与此相似,因而无须很高的氧张力;原代细胞则需在有氧的培养条件下进行,且氧张力须与组织中的状态相似;正常二倍体细胞所需的氧张力介于二者之间。一般,氧张力多对细胞增殖产生影响。当培养密度较低时,低氧分压(1—6%)适合于正常二倍体细胞株和建株细胞系的生长。在对数生长期,氧张力常需提高:适合于L-细胞生长的氧分压是9%,因为此时氨的积聚最少;适合于人二倍体细胞生长的氧分压低于5%;鼠神经干细胞(NSC)则以20%为宜。但氧张力并非越高越好,过高对细胞具有毒性作用,从而抑制细胞生长。一般来说,气液之间,通过扩散来交换气体的过程相对较慢,搅拌微载体培养则成为改善气体交换的一个重要途径。但由于目前设计的反应器搅拌速度低,导致气体交换率下降。因此,当搅拌速度低于30rpm时,或在细胞培养晚期,一旦发现细胞产量较预期低或生长率突然下降,应考虑改善气体的供应。方法有:(1)连续供气,比例为95%空气∶5%CO2;(2)通过使用含高浓度氧的混合气体增加培养基气相的气体张力;(3)提高搅拌速度,根据细胞类型及其融合程度可提高25—50%;(4)新的培养基可经适当供气,再送入反应器,这是培养基获得高张力氧的简单方法;(5)培养基通过反应器外的气体交换装置再循环。反应器氧张力的控制主要通过浸入培养液的电极发出信号来完成。常用的供氧控制方法有:(1)脉冲式直接喷雾供氧。该技术较稳定,虽可引起细胞损伤,但由于其供氧能力强,仍是细胞培养,尤其是大规模细胞培养所不可缺少的工具,适用于对剪切力抗性较强的细胞。有人提出,如培养基中加入具有保护浓度的血清或PluronicF68,则损伤作用会有所缓和。(2)使用多孔硅胶管供氧。此法是使氧气由硅管内向管外的培养液中扩散,不易产生气泡,氧气供给速度不受管内气体的流速及培养槽搅拌速度的影响。但硅管的厚度及其两侧的浓度梯度是重要的影响因素。(3)使用多孔特氟隆管供氧。疏水性多孔特氟隆(聚四氟乙烯)管是使管内的孔形成气体状的氧而扩散,并与培养液形成气-液界面,直接溶解于培养液。只要保持管内适当的压力,就可使此界面在管外形成,维持氧气的移动。但此法还有待于最佳材料的开发。另外,如管内压力过高,管表面有可能产生气泡;管内压力过低,则液体有可能浸入。控制管内的压力将是关键。特殊的生物活性培养基通常,动物细胞的生长均有赖于血清的存在,在普通培养基中,如不加血清,绝大部分细胞将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜在的污染源、不同批间蛋白含量差异大及价格高等,给生物制品的生产造成了不利。这就引发了人们对无血清培养基的研究。结果发现,只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分,如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等,不少细胞即能在无血清供应的情况下生长,尤其是CHO、杂交瘤及重组骨髓瘤细胞等。其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长的最重要的多肽。CHO细胞能在仅含重组人胰岛素一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代。在人类细胞培养中,应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长。某些细胞在无血清的条件下,其生长和抗体的产量甚至较有血清培养时高出数倍。另外,动物细胞培养应用无血清培养基的成功,还将为某些疫苗的生产降低成本。但无血清培养基并不适用于所有的细胞,一般细胞须经适应,且倍增时间延长。培养基中营养成分的改变也能影响细胞对激素的反应。Barnes等发现,Hela细胞对无血清培养基中所含的胰岛素、氢化考的松等的需要可因选用的基础培养液不同而有所差异。另外,由于培养基中所添加的蛋白主要来源于动物或人,仍然存在病毒污染的危险。因此,只有完全采用非动物来源的材料,才是相对安全的,而植物提取物