我国生物技术药物研究进展

我国生物技术药物研究进展

我国“五11”计划实施于“五12”计划开始后，对我国生物技术药物的研究和开发具有重要意义。‘十一五’期间全国生物产业发展迅速,从6000亿元升至16000亿元人民币,年增速率21.6%。2011年实现总产值近2万亿元,预计到2015年生物产业化产值将达到3~4万亿元。作者统计1999~2008年10年中国生物制药平均增速29.7%,以后的年份据吴梧桐研究资料2007~2010年平均增速为27.73%。2012年国务院发布‘十二五’国家战略新兴产业发展规划通知宣布:加速构建具有国际先进性水平的现代生物产业体系,加快海洋生物技术产品的研发和产业化,产业规摸年增速20%以上。有关部门计划‘十二五’期间投向生物医药产业的重大新药研发、创制领域专项资金在400亿元左右,比‘十一五’期间翻了一番多。无疑地这将对生物技术药物的研发在创新疫苗、单抗、基因工程药物等领域起着重要的作用。新药研发非易与之事,据统计美国FDA批准1个新药过程是:从10000个化合物(5年时间)经临床前研究筛出250个化合物(1.5年时间),进入1、2、3期临床研究筛出5个化合物(6年时间),FDA审批(2年时间)才获得1个新药。当然生物技术药物由于以DNA等为基础的生物亲缘性其研发新药的命中率可能会高一些。生物技术药物的研究水平,也就体现了我国生物技术产业发展的软实力。1细胞因子类药物的应用细胞因子具有高效能作用,一般在10-12mol/L水平即有明显的生物学作用,它以细胞因子网络的形式相互间作用的调节而发挥效能。在基因工程药物发展的初期,细胞因子类药物起到了主导作用,尽管此后有众多佳丽加盟,但细胞因子魅力未减,如在2010年世界领先的前10位生物技术药物中细胞因子占了2位,分别为GSF和EPO,销售额创记录达到35.58亿和25.24亿美元。在我国批准上市的39种生物技术药物中细胞因子占了14个。此外一些细胞因子如肝细胞生长因子(HGF)具有治疗肾纤维化前景。1.1细胞介素有近年来已完成基因重组、克隆表达和活性测定等的白细胞介素有:IL-3、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-29、IL-33、IL-35、IL-37等。1.1.1hil-101.1.2hil-31构建hIL-31基因真核表达载体,转染HaCaT细胞,可以通过自分泌的方式促进HaCaT细胞炎症相关细胞因子的表达。1.1.3hil-321.2治疗冠心病合并心脏病是临床上的重要职能之一,主要表现为以设置专门IFN是由病毒感染的细胞产生的一类因子,作用于其它细胞而干涉病毒的复制,在治疗传染性肝炎和一些癌症方面,临床上起着重要的作用。目前对IFN己进行研究并取得成效的有:IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IFNτ、IFNω、IFN-tau、集成IFNα突变体、人复合IFNα等。1.2.1新型人工化学在现有人复合IFNα结构的基础上进行氨基酸替换(N-cIFN),在大肠杆菌中表达,纯度为92%,效价测定体外活性为9×108IU。1.2.2ifn突变体if2002con-m2以抗病毒活性最高的集成IFNα和毒副作用最低的α1b为分子模版,获得兼具高活性和可用PEG修饰的IFN2-Con-m2。1.2.3天然ifn高这是一个人工设计得到的IFNα,其抗病毒活性比天然IFNα高5~10倍。另2个IFN-Con1的突变子:cIFN(R164S)和(R22S,R164S)它们对胃蛋白酶的抗性更强。1.3重组蛋白的活性SCGF基因在大肠杆菌中表达,纯度可达90%以上。纯化的重组蛋白rhSCGF-α具有生物学活性;hSCGF-α及rhGM-CSF对hUCMSCs均有刺激增殖活性,但协同作用效果最强。1.4人体胰岛素1higf-1原核可溶性表达hIGF-1,表达量占菌体总蛋白的30%~35%。具有较强的抗原活性和明显的促NIH/3T3细胞增殖作用。1.5细胞毒性检测将hVEGF165克隆于表达载体pCDNA4.0与T-GS载体共同感染CHO-S细胞,表达量50mg/L,纯度90%以上,细胞活性1.94ng/mL。1.6量试验是人内皮抑素经过基因突变得到的,具有抗肿瘤活性,在大肠杆菌中表达,目的蛋白产量达到324mg/L。rhEndostatin是通过促进β-catenin蛋白降解,降低Wnt信号通路下游癌基因survivin及cyclinD1mRNA的转录,从而抑制实验人肝癌细胞株SMMC-7721的增殖和诱导细胞凋亡的。1.7基因载体转染建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,基因载体转染的A549细胞能有效表达canstatinmRNA和蛋白,能使荷瘤小鼠肿瘤体积明显减小。2甘精胰岛素的检测在蛋白质、多肽基因工程药物研究中,新的天然结构产物的研究虽占了一定的比重,但对天然蛋白质多肽分子结构的改造已进入日程而且取得很重要的成就,如甘精胰岛素。它是经过结构改造的胰岛素,它的临床降血糖作用平稳、无峰值而且作用持久,在2010年世界销售领先的10大生物药物中排到第7位,达到46.53亿美元。而小分子合成多肽也不容小觑,一个由谷、丙、酪、赖组成的4肽,治疗多发性硬化症,也排入第9位,年销售33.15亿美元。2.1hv3和hv3的比较构建HVⅢ突变体库R33G34D35X36-rHVⅢ,从中筛选出具有与rHV3抗凝血酶活性比活力相当,同时又具有很强的抗ADP诱导的血小板聚集抑制率的双作用靶点水蛭素Ⅲ突变体。该突变体库第36位氨基酸位点为Met和ser时,突变体具有很好的抗凝血和抗ADP诱导的血小板聚集的双重药理活性。2.2人类胰高血糖素样品2pp-h、gly2、glp-21-35用尾酶法构建人胰高血糖肽样肽-2类似物,改变融合伙伴后,目的肽的表达量从0.106g/L提高到0.372g/L。2.3oxlig-1/r2-gpi/nb免疫产物的形成重组表达人源β2-GP1及其第V结构域基因,获得了高水平表达,且具备活性,可抑制oxLig-1/(r)β2-GPI/Antibody免疫复合物的形成。2.4gc9010基因表达以苦瓜基因组为模版,在毕赤酵母中高效表达MAP30蛋白,Mr32000,重组蛋白占上清液重蛋白67%,目的蛋白总回收率32.4%,具有明显的抑制人胃癌细胞SGC7901活性,IC50为30μg/mL。2.5小鼠皮下注射、口服糖耐量、胰岛素释放量实验结果融合表达Exendin-4类似物,表达量占菌体总量的40%,纯度达到91.8%,小鼠皮下注射、口服糖耐量实验,可显著降低血糖和显著促进胰岛素分泌的活性。2.6新a类细菌素在大肠杆菌中高效表达,纯度95%,产量36.1mg/L。对单核细胞增生李特氏菌有明显的抑制作用。2.7sec2突变株利用SEC2基因截短技术,获得保留T细胞刺激活力又不引发催吐效应的SEC2突变株(NSM),NSM可显著刺激T细胞增殖,并且可显著抑制人大肠癌细胞(CX-1)和人乳腺癌细胞(MCF-7)生长,显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长,而且不再诱发动物呕吐效应。2.8临床疗效研究重组EXf作用H2O2诱导INS-1胰岛β细胞凋亡模型,可使INS-1胰岛β细胞存活率明显增加,明显抑制DNALadder的出现,并呈现一定量效关系。趋化素样因子(CKLF1)是一个新的促炎因子,是一个自身免疫疾病和过敏性疾病的药物治疗靶标。CKLF-C19是其拮抗肽,不仅可拮抗多种趋化因子及受体介导的细胞趋化功能,在小鼠哮喘模型中可明显抑制Th细胞如嗜酸性粒细胞在肺部的浸润,降低氧通道反应性。2.10免疫源性的变化在大肠杆菌中高效表达hINGAP,表达量占菌体总蛋白的40%左右,纯度达到98.81%,具有良好的免疫源性,动物实验表明,它能促使胰岛细胞再生,逆转链脲佐菌素诱发的糖尿病。2.11人体肝脏星形激活相关蛋白stp重组表达了hSTAP,可抑制次氯基三乙酸铁对肝星状细胞造成的氧化应激作用。2.12人体疾病的相关体rh-apo我国独立研发的一种抗肿瘤生物制剂。1期临床研究表明对人体安全性较好,可能具有一定的抗肿瘤疗效。2.13鸡胚绒膜血管增殖细胞系统在大肠杆菌中表达人胸腺素β16,比活性5.3×105U/mg。在体外可促进BALB/c3T3细胞、兔角膜细胞、血管内皮细胞及鸡胚绒毛膜血管增殖;在体内可促进家兔碱烧伤皮肤愈合。2.14细胞免疫诱导Humanin是人体内发现的内源性多肽,能保护神经细胞免于各种早老性痴呆症及相关因素诱导的凋亡。HN肽链第14位氨基酸被Gly取代后的突变体,重组表达的神经保护肽(HNG)的神经保护作用与天然的HNG相近。2.15产量及分布构建了鲨肝活性蛋白原核分泌表达载体,获得rSHAP,纯度95%,产量约318mg/L。具有刺激SMMC-7221细胞株增殖活性,体外活性检测显示15~45μg/mL的rSHAP能够显著提高正常人肝细胞HL-7702葡萄糖激酶活性。2.16小剂量顺铂以及其他常用的协同抑制剂经计算机辅助设计获得的抗癌多肽A38能抑制人胃癌细胞株SGC-7901细胞生长,诱导细胞早期凋亡,小剂量顺铂与A38联用具有协同抑制作用,且效果比高浓度下的单用A38或单用顺铂的作用明显。2.17安氏体异构体小肽acsdkp以D型氨基酸替代的方式构建一种能抵抗血管紧张素转化酶(ACE)降解的异构体小肽AcSDKP,AcSDKP能抗ACE降解,在体外能抑制成纤维细胞增殖、抑制BMSC向巨噬细胞分化。2.18血管紧张素ng1-7异构体血管紧张素ng12以D形氨基酸替代的方式构建2种能抵抗胃蛋白酶降解的血管紧张素Ang1-7异构体小肽血管紧张素改构体1和2。改构体能抵抗酶的降解,在体外能结合于A549细胞表面抑制A549细胞增殖。2.19avastin的耐药性整合素阻断剂类多肽,动物实验证明AP25抗肿瘤作用显著(相当于avastin),不容易产生耐药性,毒副作用低。人工合成L-酪氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸三肽,临床研究表明酪丝亮肽可抑制HCC细胞发生的腹壁转移、腹膜转移、肝内侵袭和肝转移。3tnf-b-b融合蛋白是生物技术药物研究中最精彩的华章。融合蛋白药物在临床应用范围上,遍及治疗学中各主要领域。基因-基因的融合可创造更多的性能比天然生物药物结构更好的新药。融合蛋白可使药物功能增强(如两种不同抗菌肽的融合、抗体与力达霉素辅基蛋白的融合);体现双功能或多功能(如溶栓作用并具抗凝血作用、加速创伤愈合并有抗感染作用);延长药物在体内的半衰期(融合人血清白蛋白);药物突破血脑屏障(融合穿膜肽);药物体内转运的靶向性(融合主动靶向载体蛋白)等。在技术上融合蛋白也比较成熟,而且已有药物在临床上应用多年,Entrel是最早于1998年美国FDA批准临床应用的一种可与TNF结合的偶联可溶性受体,治疗风湿性关节炎,2005年开始就居全球生物技术药物销售额之首,达到37亿美元,2006年44.79亿美元,到2010年达到68.08亿美元。我国批准了重组肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白上市。其它人血清白蛋白和PEG分子后修饰的基因工程药物,许多都先后批准应用于临床治疗。下面反映的是我国科技工作者近期在这一领域的研究成果。3.1重组蛋白的融合肿瘤血管导向性干扰素(TFN-α2a-NGK)、重组凋亡融合蛋白(TRAIL-Fc)、FGF21-L-Fc融合蛋白、重组人粒细胞集落刺激因子融合蛋白(GW003)、谷胱苷肽硫转移酶-人核糖核酸酶抑制因子融合蛋白(GST-hRI)、融合蛋白1hFVⅡ-LDM、GST-人S100A2融合蛋白、人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白、人促黄体激素释放激素-绿脓杆菌A融合蛋白(LHRH-PE-40)、人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白、含人Fc重组凋亡融合蛋白(TRAIL-Fc)表皮生长因子受体干扰序列-白细胞介素24融合蛋白(EGFRi-IL-24)、重组CTB-GADⅢ蛋白、DNaseⅡ融合蛋白(PLTD)、EGFRvⅢ-HBcAg融合蛋白、BDNF-LINGO-1-Fc融合蛋白、GADⅢ蛋白、CTLA-4Ig融合蛋白、靶向IL18-EGF融合蛋白、靶向表皮生长因子受体的寡肽配体与力达霉素强化融合蛋白、融合蛋白KininogenD5_(60-148)-TRAIL-(114-281)、人骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白、抗凝溶栓双功能HV12p-rPA融合蛋白、重组双功能水蛭素12肽-瑞替普酶(rPA)融合蛋白、GM-CSF/IL-3融合蛋白、BPI_(23)-haFGF融合蛋白、抗EGFR单链抗体与力达霉素融合蛋白、白细胞介素-1受体拮抗剂与免疫球蛋白E融合蛋白。靶向抗肿瘤VEGF-α-Gal融合蛋白、GSFhS1009A融合蛋白、人超氧化物歧化酶-胸腺素α1融合蛋白、抗CD20单链抗体与力达霉素强化融合蛋白、hK1-L-Fc融合蛋白、人干细胞因子模拟肽与c-JUN亮氨酸拉链融合蛋白、重组融合蛋白EGFE4orf4、人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ与IgGFc融合蛋白、人白介素-4二硫键异构酶DsbC融合蛋白、抗HIV融合多肽、可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白(sTNFRⅡ-gAD)、PEP-1-CAT融合蛋白、靶向IL18-EGF融合蛋白、靶向融合蛋白XE-TNFαm2、人干扰素α2b和IgGFc融合蛋白、人表皮生长因子8p67信号肽融合蛋白、抗乙肝病毒表面抗原单链抗体与γ-干扰素融合蛋白、重组胸腺素α1(TM-α1)与复合α干扰素(IFNα-con)融合蛋白、KininogenD5和TRAIL融合蛋白、重组人B7-H4IGⅤ融合蛋白、截短组织因子tTF的融合蛋白、葡激酶-水蛭素融合蛋白、天蚕素-马盖宁融合蛋白、TNF受体-血管活性肠肽融合蛋白、血管生成素-干细胞因子融合蛋白(TPO-SCF)、降钙素-骨生长肽融合蛋白(SCT-OGP)。3.2人血清氨基酸突变体ames重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白(HSA-IFN-α2a)、重组人血清白蛋白-干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)、重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白(rHSA-GCSF)、HSA与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白(HAS/GM-CSF)、重组骨保护素片段与人血清白蛋白融合蛋白(rhOPG179-HAS)、重组白蛋白融合人胰岛素样肽突变体的串联体[rh(GLP-1A2G)2-HAS(GGH)]、IL-1RaHAS融合蛋白、人β干扰素-人血清白蛋白融合蛋白、ApotPA融合蛋白、融合蛋白STH、人甲状旁腺素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白、人Leptin基因融合蛋白、截短型胰高血糖素样肽-1融合蛋白(SGLP-1/HSA)、KGLP-1/HSA融合蛋白、人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白、HSA-GHRH融合蛋白。3.3mdc-egfp/mdcsfp融合蛋白的相关变化带有穿膜肽重组DTD-KLF4、人酸性成纤维细胞生长因子与穿膜肽融合蛋白、细胞穿膜肽融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ、Sox2-Rp-EGFP融合蛋白、携带11R穿膜肽p53融合蛋白、家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白(Mdc-hly)、人抗HER2单链抗体/精氨酸九聚融合蛋白(scFv-9R)、重组融合蛋白IL-3-PE38KDEL、多聚精氨酸转导域-凋亡素融合蛋白、PTD-SARA融合蛋白、(RGD)3/tTF、VEGF-抗菌肽融合蛋白、天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白。3.4peg通过修饰多肽蛋白质1991年用于治疗儿童免疫缺陷症的第一个PEG-腺苷脱氨酶(adagen)获FDA批准上市。目前已有PEG修饰的门冬酰胺酶、IFNα2a和2b等多种生物技术药物批准应用于临床。PEG定点修饰多肽蛋白质的途径主要有:氨基修饰、巯基修饰、羟基修饰、羧基修饰、糖基残基的修饰等,修饰后的蛋白质、多肽最显著的是PEG的多聚物增加了结合蛋白的分子质量大小,降低了肾脏的滤除率,从而延长了药物的半衰期,增强了药物在体内的活性、理化稳定性及降低了药物的毒性和免疫原性等。我国PEG-蛋白质分子后修饰主要品种有:PEG修饰尿酸酶(PEG-Uricase)、PEG修饰促胰岛素分泌肽(PEG-Ex4C)、PEG修饰IL-6(PEG-rhIL-6)、PEG修饰人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhGCSF)、PEG-HM-3等。4抗菌肽的形成细胞穿膜肽是一类以非受体依赖方式、非经典的内吞方式直接穿过细胞膜的多肽。穿膜肽的防御肽部分如抗菌肽(AMPs)能在极短的时间内2~3min杀死微生物。一部分抗菌肽还具有明显的抗肿瘤活性,又被称为抗癌肽(ACPs)。穿膜肽的另一重要作用就是在体内起到传递生物活性分子(蛋白质、核酸、小分子物质),这对药学和治疗学领域为药物递送及靶向治疗提供了新的途径。CPPs穿膜机制一般认为是:CCPs或CCP2与小分子的结合物内化进入细胞是通过静电作用和形成氢键的易位或转导作用;而CPPs与大分子的结合物是通过能量依赖的内吞作用,特别是胞饮作用进入细胞。抗菌肽(AMPs)最早在昆虫体内发现,此后,天然抗菌肽和基因重组抗菌肽平行发展。目前已经过鉴别的AMPs超过2000种,研究的AMPs超过8000种。在美国FDA批准上市的AMPs有Cubicin,用以治疗革兰氏阳性菌引起的皮肤感染;正在临床前和临床研究的有11种。在抗菌肽基因重组表达方面尚有一些困难要克服:①由于抗菌肽是小分子碱性多肽,极易受到体内蛋白酶的攻击;②很多抗菌肽都含有二硫键翻译后修饰,因此外源性表达较其他多肽类药物更复杂;③由抗菌肽自身的抗菌作用对宿主工程菌产生自噬,限制了高表达的水平,但AMPs因广谱抗菌、热稳定强、对病原体不产生抗药性等特点,倍受人们关注。我国已研究获得成果的抗菌肽有:棕点湍蛙抗菌肽、抗菌肽Folicidin-3、合成抗菌肽TachyplesinI、杂合抗菌肽HMCM、杂合抗菌肽(ADM)、β-发卡抗菌肽、新型抗菌肽(MDP-1和MDP-2)、霉肽素(AF)、新型穿膜肽(CGRLWMRWYSPWARRYGC)、家蝇防御素(defensin)、海蚕抗菌肽(perinerin)、抗真菌肽(Drs)、人源抗菌肽(IL-37)、中国家蚕抗菌肽(ABP-CM4)、Magainin的融合肽、牛娃Tempurins抗菌肽、中国林蛙皮肤抗菌肽、抗菌肽Cecropin、人类抗菌肽hepcidin、抗菌肽CM4、抗菌肽CP10A、抗菌肽GKI、抗菌肽DermaseptinS4等。5溶栓治疗药物的选择酶在治疗药物中作用机制明了,专一性强,靶点明确,因此在消化性疾病、心血管疾病的溶栓治疗及遗传缺陷病的治疗等方面成了不可替代的首选药物。我国有5种重组药用酶上市。我国正在研究的药用酶主要有:5.1alf在毕赤酵母溶血栓中的活性该酶为ALF的N端突变体,属金属蛋白酶,其溶血栓的速度是传统的纤溶酶原激活酶的6倍,有纤溶活性而无出血活性,已建立了ALF在毕赤酵母高效活性分泌性表达系统。5.2蛇毒酶anschod采用酵母偏录密码子合成了ancrod全长基因,其比活力与天然ancrod相近。5.3游泳纤溶酶efe是从赤子爱胜蚓中克隆到一种纤溶酶新基因Efp-o,在大肠杆菌中表达,具有抗凝和溶栓作用。5.4嗜血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂bt-pa首次在体外人工合成Bat-PA全长基因序列,在毕赤酵母中表达,产量达到30mg/L。5.5治疗经口损伤CAT能高效清除过氧化氢,阻断体内高毒性的羟自由基的生成,用于抗烧伤、缺血再灌流及肺炎损伤等的治疗。CAT在毕赤酵母中表达,纯度高达到95%以上。5.6rsjluss对革兰氏阴性和阳性菌的抑菌效果在大肠杆菌中表达得到酶活力为19.2U/mg的rSjLys,对革兰氏阴性、阳性菌均有抑制作用,尤其对常见的海洋致病菌副溶血弧菌和铜绿假单孢菌具有很强的抑菌活性。5.7plg-sp的制备研究重组人纤溶酶原丝氨酸蛋白酶结构域(rhPLG-SP)的酵母表达,表达量400mg/L,纯度大于96%,等电点pH7.5、Mr27877、比活性23.6U/mg。5.8尿激酶激活速率从毕赤酵母表达RGD-hPGL-K,产量0.16g/L,纯度90%以上,其尿激酶激活速率和纤溶活性与hPLG-K无显著差别,而血小板聚集抑制率显著高于hPLG-K。5.9lg1hlyz酶在大肠杆菌中表达人溶菌酶,Mr约40000,表达量占菌体总量的46.5%,纯度95%以上,hLYZ酶活力为2389U/mg,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抑制作用。5.10磷酸酶uc合成黄曲霉尿酸氧化酶基因,大肠杆菌表达,目的蛋白占菌体总蛋白的50%,纯度为95%,体外活性测定具有分解尿酸的能力。5.11人源基酶-2氨基c-2c-血浆遗传因子实体段pexPEX在大肠杆菌中表达,在鸡胚脲囊膜模型上研究,具有抑制血管生成,进而抑制乳腺癌BICR-H1细胞的生长和转移作用。5.12民机基因重组蛋白β-内酰胺酶是一种可以用于肿瘤生物治疗ADEPT(单抗导向酶活化前药)重组蛋白,Mr约为42000,得到的纯化蛋白具有较好的肿瘤细胞靶向性。6rnai在其他特殊细胞中的调节作用RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的序列特性转录后基因沉默过程,是通过双链DNA分子在mRNA水平上关闭相应基因的表达,对引发RNAi现象的小片段RNA双链分子即为小干扰RNA(siRNA)。RNAi技术为人类疾病发病机制研究和基因治疗开辟了一个新领域。由于siRNA技术的巨大潜力,世界各国都一直致力于该技术的完善,推向临床治疗的实际应用。目前有用于治疗可导致失明的老年黄斑变性症(AMD)、由呼吸道融合病毒(RSV)所引发的小儿疾病RNAi药物,用于癌症治疗的CALAAOI及ALN-VSPO2都已进入临床试验。我国在肿瘤治疗方面的实验研究方面取得成果有:利用靶向CCK-B受体的siRNA能阻断人胃癌SGC-7901细胞系CCK-B受体的表达、细胞增殖受到明显抑制;靶向kappaBP65的RNAi研究显示体内抗肿瘤实验能抑制裸鼠移植模型的肿瘤细胞增殖;将VEGF特异性siRNA转染人类卵巢癌细胞系,结果显示VEGF在mRNA和蛋白质表达水平均受到明显抑制,细胞增殖及侵袭能力明显下降;在人类结肠癌HCT116细胞系中,VEGFsiRNA显著下调VEGF蛋白表达,抑制细胞增殖及转移。该siRNA还能抑制HIF-1a(含氧诱导因子-1a)的表达水平,阻断肿瘤血管的生成;利用在大肠癌中高表达的Bcl-xL基因的特异性siRNA转染大肠癌HT29细胞,结果显示该基因在mRNA和蛋白质表达水平被显著抑制,细胞uPA蛋白水平也明显下降,大肠癌细胞恶性侵袭能力明显下降;相应的siRNA使Survivin和Livin基因表达下调,显著的抑制了肿瘤细胞的增殖;通过RNAi干扰骨髓细胞系RPMI8226的TRAF6表达,抑制了骨髓瘤细胞生长。RNAi特异下调Hela细胞β-catenin的表达后,许多促凋亡基因被活化,促进了细胞的凋亡;此外应用RNAi技术在胃癌、大肠癌和肝细胞癌的实验研究中都取得了明显效果,对子宫内膜癌、肺癌、荷瘤裸鼠均显示在体内有抑制肿瘤生长的作用。这些实验结果说明RNAi治疗技术的可行性和有效性,但用于临床尚待进一步研究。其他有关siRNA的研究项目还有:沉默核糖核酸酶抑制因子(RI)、LivinsiRNA、miRNA-29c、Id2shRNA、RNA干扰PDK-1、APE1siRNA、shRNA-β-catenin、microRNA-99a、amiRNA、siRNA-STAT3、siRNA-BMP、siRNA-COX-2、1504-siRNA、HPIPsiRNA、DcR3siRNA、CT45-5-siRNA、siRNA-HIF-1α、siRNA-BSP、siRNA-PrxI、siRNA-PESI、siRNA-NRP1、shRNA-p115、hTERT-shRNA等。6.2反义核酸的药效学研究反义核酸是根据碱基互补原理,利用特异互补的DNA或RNA片段与目的序列核酸结合,通过空间位阻效应或诱导的RNase活性的降解作用,抑制或封闭目的基因的表达。国外,反义核酸vitravene于1998年上市,以后又有10多个反义核酸药物上市。已进入临床研究的反义核酸新药约有38种,处在实验室研究阶段的达上百种。我国也在此领域做了大量研究工作,近期完成的如下:反义核酸可以抑制肿瘤的生长、增殖、分化及诱导等凋亡。PKC、cyclin及CDK基因的变异和肿瘤的发生有密切关系,利用反义RNA技术,抑制乳腺癌细胞PKCα的表达,结果显示细胞增殖速率明显减慢,cyclin与CDK4的表达水平下降;PEI介导的蛋白激酶α(PKα)基因反义核酸(ASODN)能诱导人肺癌细胞的凋亡;WT1反义核酸明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率达49.48%,凋亡率为13.18%;靶向过氧化物酶增殖活化受体α(PPARα-2)高核苷酸可剂量依赖性地抑制肝癌细胞中HBsAg和HBeAg的表达,显著降低细胞中PPARαmRNA水平和蛋白水平,同时也验证确定了PPARα可能成为HBV药物作用的靶点;比较了NDP-1反义寡核苷酸与VEGFR-2反义寡核苷酸对人胃癌SGC7901的细胞增殖的凋亡的影响,证明两者均有抑制人胃癌SGC7901细胞增殖活性,促进细胞凋亡,两者联合转染比单独作用明显增强;人反义端粒酶能明显减低BEL-7402肝癌细胞的黏附和侵袭能力,其机制可能与上调E-cad的表达、下调INTβ1的表达,并抑制MMP-2和MMP-9有关。6.3基因治疗在多种致命性疾病中的进展基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷式异常引起的疾病,从而达到治疗的目的。基因治疗的研究历尽波折,1990年因治疗腺苷脱氨酶缺陷病人曾获得成功引发了世界基因治疗的研究热潮。1999年由于经基因治疗的一例患先天性鸟氨酸转甲酰胺酶缺陷症的患者死去而使研究蒙受重创。在1990~2001年间,全世界已有532个基因治疗的临床试验在各国展开,19000名以上的志愿者参与其中,结果并不如意。但该研究并没有因此而停顿,2009年因治疗先天性黑蒙症(LCA)使基因治疗出现了转机,被评为:‘终点线前的最后冲刺’。美国Science杂志公布了2009年的十大科学突破,第7项就是:基因治疗在多种致命性疾病中获得成功。至今美国FDA尚未批准一个基因治疗产品上市,而我国SFDA批准的基因药物上市的有2种:重组人p53腺病毒注射液,重组人5型腺病毒注射液。至今我国已有20多个基因治疗项目申请临床试验,申请的治疗领域主要是肿瘤、遗传性疾病(如血友病)、传染病(慢性乙肝)、慢性疾病(如下肢血管闭塞症)等。2009年我国基因治疗临床研究的产品有,重组腺病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因制剂、特异性溶瘤重组腺病毒注射液KH901、重组人内皮抑素腺病毒EDS01、重组腺病毒肝细胞因子注射液(AD-HGF)、AAV-hFIX肌肉注射液,基因溶瘤腺病毒注射液(SG600-P53)、OrionX010重组人GMCSF单纯疱疹病毒注射液。‘十一五’863计划“基于功能基因组和结构基因组的药物分子统计”实验结果也令人鼓舞,该项目发现并确认了5个新化合物进入临床前研究;鉴定了9个治疗用肿瘤药物的新靶标;开发及结构优化了针对哮喘相关的趋化因子CKLF1为靶标的药物先导化合物;发现了并具抗肿瘤生长和转移的候选药物MTC-200;抗艾滋病药物候选物F18等。我国基因治疗Ⅱ型糖尿病取得进展,“突变性葡萄糖激酶基因治疗Ⅱ型糖尿病”,现已进入中试阶段。该项目申请了国际专利。近期完成的治疗基因实验研究项目如下:(1)抑制肿瘤mosm是对胰腺疾病的载体ad-osm(2)mir29c重组腺体病毒ad5f11pmir29cAd5F11p-miR29C可使骨髓SKO-007细胞凋亡率达到26.5%,XG7细胞的凋亡率46.9%。(3)损伤的治疗pUDK-HGF对大庆霉素诱导的人鼠肾纤维化损伤可使肾功能有所改善,缓解肾纤维化的进展。对已纤维化肾脏直接注射HGF基因,可促进肾间质血管再生,并进一步降低肾小管间质损伤积分。(4)胰腺疾病基因-p1b肿瘤adcvm-p16AdCMV和P16协同作用,能增强对SMMC-7221肝癌细胞移植瘤的抑制作用,促进移植瘤细胞的凋亡。(5)新型吸毒性腺体cnh500-h7治疗非常广阔疾病的功能干细胞是一种具有自我复制和多向增殖分化潜能的未分化细胞,能培育成肌肉、骨骼和神经等人体组织和器官,可用于治疗白血病、先天性代谢疾病、某些实体瘤、糖尿病、心脏病和脑瘫等多种疾病,具有非常广阔的医疗用途。全球干细胞医疗市场大约有800亿美元,如果将药物等有关产业计算在内,2020年全球市场规模可达4000亿美元,是21世纪世界重点战略新兴产业之一。7.1国家批准的fna批准的临床干预项目骨髓原始间充质干细胞、间充质干细胞心梗注射液、自体骨骼间充质干细胞注射液,脐带血巨核系祖细胞注射液、脐带血红系祖细胞注射液。7.2术准入阶段目前干细胞药物尚未获FDA批准应用,自体成体干细胞、供受者1对1的异体干细胞尚处于三类技术准入阶段(医疗技术)。以造血干细胞为例,非相关供体白细胞(HLA)配型相合率只有10万分之一。从脐带血配型,理论上配型几率是1/10000到1/400,如果脐带血库有足够大,则每个患者都有可能找到合适的脐带血干细胞。如果不能形成产业,干细胞受惠的患者群将大大减少。7.3联合用药细胞hsc、成体干细胞如间充质干细胞主要包括胚胎干细胞(ES)、诱导性多能干细胞(iPS)、成体干细胞(如间充质干细胞MSC和造血干细胞HSC)。间充质干细胞除了人脐带血、人脐带(比脐带血更好)外,最近又发现胎盘组织,取材更方便,而且没有伦理问题。7.4我国早期干预临床药效学的探讨7.4.1治疗青少年特殊类型患者的疗效自体骨髓MSC能显著改善心肌梗死患者左心室的功能;自体骨髓MSC移植治疗24例肝衰竭、肝硬化失代偿期患者,肝功能、凝血功能、肝炎贮备功能明显改善,缩小的肝脏有所增大。能够相对降低肝硬化患者发生肝细胞癌的风险和死亡率;对60例末期肝硬化患者治疗安全有效,能改善肝功能、凝血功能及临床症状;对30例肝炎患者,经自体干细胞回植治疗后,HBsAg、HBeAg、抗-HBc、抗HBe及HBV-DNA均转阴,临床症状无反弹,表明体内肝炎病毒清除,且无病毒复制,其中多数病例肝功能也明显改善,ALT、AST水平恢复正常,彩超指标较治疗前均有明显好转;骨髓MSC与异基因造血干细胞移植能显著降低植物抗宿主病(GVHD)的发生率;移植自体的G-CSF动员的外周血单个核干细胞能改善糖尿病患者的严重肢体缺血;移植自体骨髓干细胞(BMSCs)治疗Ⅱ型糖尿病可改善其胰岛功能,减轻对外源性降糖药物的依赖;用脐带间充质干细胞,治疗脑瘫患者229例,治疗前后ADL评分总分、步行动作、床上运动、认识交流动作比较证明对智力障碍脑瘫患者治疗有效,另外还有报导对脑外伤的试验结果;用树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养细胞过继免疫治疗儿童急性白血病,44例接受DC-CIK治疗后44例患儿持续完全缓解,不良反应轻微;以异常行为量表(ABC)的效度对23例儿童孤独症患者用脐血单核细胞(CBMNCs)与脐带血间充质干细胞(UCMSCs)治疗的疗效进行评价,结论应用干细胞联合康复训练治疗儿童孤独症疗效显著高于单纯康复训练组。按ABC表中嗜睡与刻板行为评分,CBMNCs联合UCMSCs+康复治疗组疗效最良好。回顾性研究531例中晚期恶性肿瘤手术于放、化疗后静脉输注DC-CIK细胞治疗的疗效,DC-CIK细胞安全、有效,能明显增强免疫功能,改善生存质量,提高3年生存率;以CIK治疗119例肾细胞癌患者作为治疗组,IL-2联合IFN治疗的119例肾细胞癌作为对照组,结果CIK免疫疗程可以显著改善Ⅲ、IV期肾细胞癌患者的预后,增加CIK治疗疗程可以提高疗效。7.4.2骨髓间充质细胞治疗间充质干细胞对治疗小鼠放射性损伤、大鼠创伤性脑损伤、兔股骨头坏死、大鼠脊髓损伤均有良好的恢复作用;γ射线照射后的IL-15基因修饰的NK细胞对原代卵巢癌细胞有明显的杀伤作用;树突状细胞诱导的CIK细胞(DC-CIK)对肺癌皮下移植瘤细胞的抑制率达到70.3%,明显高于DC或CIK细胞的抑制作用;研究骨髓间充质细胞(BMSCs)对大鼠离体肝切除自体肝移植功能的保护作用;证明BMSCs能通过门静脉注射入肝,改善移植大鼠后肝功能;将微载体培养的永生化肝细胞(IHH)注射于用CCl4建立的裸鼠ALF模型腹腔内进行腹膜透析治疗,未治疗组及空微载体治疗组48h全部死亡,而采用IHH治疗组48h动物生存率为83.3%,持续14d后转为长期存活;对大鼠溃疡性结肠炎(UC模型),MSCs可促进UC大鼠损伤结肠的修复,部分MSCs可分化为结肠上皮细胞参与损伤的修复;比较骨髓间充质干细胞和全骨髓细胞治疗免疫介导再生障碍性贫血小鼠的疗效,单独使用骨髓间充质干细胞治疗能够部分使再生障碍性贫血小鼠症状改善、造血功能恢复。骨髓间充质细胞治疗有效率不如全骨髓细胞,但两组无显著差异;利用腺病毒载体技术,研究目的基因修饰的人源性外周血单核细胞来源的树突状细胞对抗人类免疫缺陷病毒-1的感染,目的基因修饰后对人类免疫缺陷病毒-1的抵抗力明显增强。8生物技术药物单抗的市场复合增长率高单克隆抗体是继重组蛋白药物之后引领的世界生物制药第二次高潮。2010年单克隆抗体药物以480亿美元的销售额继续领跑全球药品市场,2000~2010年10年的市场复合增长率高达32%。2010年在全球20个处方药和10个领先生物技术药物中单抗分别占了6个,每个品种年销售额29.36~65.48亿美元。IMS数据2007年全球单抗药物已占整个生物技术药物的34.4%,而在中国仅占1.7%,远远低于全球平均水平。我国已批准生产的治疗性单抗产品有2个,另3个正处于临床试验阶段,多个单抗药物处于临床前研究阶段,已批准的诊断性单抗有31个。8.1克隆抗体注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体(OKT3),免疫抑制剂,可逆转对移植器官的排斥反应;恩博克乳膏(抗人白细胞介素-8单克隆抗体),用于银屑病。8.2肺癌单抗免疫治疗剂碘人鼠嵌合型肿瘤细胞单克隆抗体注射液(131I-chTNF,用于实体瘤;碘131I肝癌单抗免疫诊断和治疗剂,用于肝癌的体内定向诊断和导向治疗;人源化单克隆抗体h-R3,hR3是继用于治疗结肠癌淋巴癌转移患者的Panorex和用于治疗转移性乳腺癌Herctptin之后第三个单克隆抗体实体瘤治疗药物,比美国同类药物Erbitux人源化程度更高。8.3在临床前研究中，单抗抗CEA嵌合抗体,治疗结肠癌;破伤风抗体,预防破伤风;抗乙型脑炎单抗,用于乙型脑炎;抗Fabc1027,用于治疗肝癌。8.4单克隆抗体hula-332、mabf抗肿瘤坏死因子-α单链抗体在大肠杆菌中表达,Mr28000,表达量占总菌体蛋白的15%;抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体2嵌合抗体在CHO细胞中表达,对体外培养的人淋巴细胞白血病细胞SVT35有显著的杀伤作用;TNF-α单克隆抗体可以减轻实验鼠梗阻性黄疸的肾损伤及对肝肺综合征实验大鼠有治疗作用;131I-肿瘤细胞核人鼠嵌合单抗(131I-chTNT)治疗12例突发性胶质瘤病人,总有效率66.6%;抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单抗(IFX)IFX对中、重度活动性RA患者有较好的短期疗效,迅速改善RA患者的病情,尤其对中度RA患者疗效更显著;抗白细胞介素6单克隆抗体(anti-IL-6mAb)延长同种小鼠移植心脏的存活时间;重组hIL-31抗体,IL-31抗体能使皮肤炎症中的炎性细胞减少,血清中炎症相关细胞因子明显降低;VEGF受体Ⅱ胞外Ⅲ区单克隆抗体,能特异阻断血管内皮细胞生长因子与KDR分子的相互作用,有良好的特异性和中和活性;抗血管内皮生长因子受体-2双价单链抗体(BsFv),在大肠杆菌内表达,纯度90%,可剂量依赖性抑制HUVEC细胞增殖,抑制效果优于AK404;血管生长因子VEGF165单克隆抗体,在大肠杆菌表达,mAb能抑制鸡胚血管生成,抑制HUVEC迁移及血管形成;人表皮生长因子受体α人源化单克隆抗体(rhHER2-mAb),在CHO细胞表达,表达量(152±20)mg/L,纯度95%以上,其活性亲和力与赫赛汀相当;抗表皮生长因子受体的单链抗体(ERCFv),在大肠杆菌表达,表达量10mg/L,对肿瘤细胞具有良好的亲和力和一定的生长抑制作用;bFGF单克隆抗体(MabF),MabF可明显抑制C57BL/小鼠Lewis肺癌生成及转移,其作用与抑制肿瘤增殖及微血管生成相关;人鼠肉瘤OS-732单克隆抗体,通过杂交瘤细胞腹腔注射BALB/C小鼠制备腹水,纯化后纯度93%,ELISA抗体免疫活性效价为1×10-7;抗人DR5功能性单克隆抗体(mDRA-6),mDRA-6通过激活外源性膜受体,继而启动细胞线粒体途径导致Jurkat细胞凋亡;Aβ1-42单克隆抗体(Aβ1-42mAb),可改善AD大鼠的认知功能,其机制可能与抗原体结合减少Aβ积聚,亦与调节ChAT活性有关。9预防免疫反应治疗性疫苗是一类用于治疗疾病而非用于预防疾病、通过打破慢性感染者体内免疫耐受,重建成增强免疫应答的新型疫苗。而预防性疫苗则主要是用于未感染的健康个体。世界上第一个肿瘤治疗疫苗——表皮生长因子(EGF)肿瘤性治疗疫苗已于2008年上市。目前世界已有52种肿瘤疫苗正在进行临床I、Ⅱ期研究。9.11乳腺癌和肺癌ICT-107(适应症:胶质母细胞瘤);VGX-3100(子宫颈非典型增生和癌症);MAGE-A3(皮肤癌和肺癌);NewVax(同时联合GM-CSF应用,推迟低到中等水平乳腺癌患者的疾病复发和发展);AE37(乳腺癌);Nexvax2(乳糜泻);ADXS-HPV(子宫颈及头颈部癌);CRS-207(胰腺癌);PEV7(复发性外阴道念珠菌病);GI-4000(胰腺癌)。9.2中国治疗性疫苗的进展9.2.1口服幽门螺旋杆菌疫苗是我国率先在世界上研制成功的,具有独立知识产权的口服疫苗,预防和治疗胃幽门螺旋杆菌感染。9.2.2多肽疫苗reeq-th蛋白疫苗(HBsAg+人抗-HBs免疫球蛋白),Ⅲ期临床;多肽疫苗(MAP短肽,TT830、HBc18~27),Ⅱ期临床;多肽疫苗(PreS2B细胞表位,破伤风类毒素通用Th表位连接于HBV免疫优势表位的N-末端及C-末端构成的多肽),Ⅱ期临床;蛋白质疫苗(亚单位疫苗+LMS+CIM)、丙肝疫苗、DNA疫苗均处于临床前阶段。9.2.3子宫颈癌的治疗插入革登热病毒RNA,复制子的抗原基因可以是肿瘤抗原基因和病毒抗原基因,含有这种载体的基因可以预防和治疗肿瘤及病毒性疾病。9.2.4艾滋病毒DNA-天坛痘苗复合型爱滋病疫苗,已完成Ⅱ期临床试验;DNA/MAV载体爱滋病疫苗已完成Ⅱ期临床试验。9.2.5疟疾原生动物感染与肺癌dna疫苗联合使用该机制有可能用于肺癌的免疫治疗,也可能作为携带抗原的新载体用于开发新型有效的治疗性肺癌疫苗。9.2.6基因疫苗mage-1、il-18人和鼠可溶性VEGFR2的双基因疫苗(pVITRO2-hm-sVEGFR2),该疫苗能明显抑制新生血管生成活性,其作用大于人和鼠的单基因疫苗;PVAX-MAGE-1基因疫苗,可显著延缓移植性H22腹水瘤及实体瘤在子宫体内的生长,其抑瘤作用与提高T淋巴细胞IL和IFN表达,增强对肿瘤的杀伤作用有关;共表达基因疫苗MAGE-1/IL-18抗肿瘤疫苗,该疫苗在实验动物体内有显著的诱导特异性抗肿瘤免疫作用,对肿瘤的生成有一定的抑制作用;对MAGE-1阳性肿瘤细胞有明显杀伤作用;人乳头病毒16型E5与IL-12联合基因疫苗,该疫苗能刺激机体产生较强的免疫应答,联合基因疫苗优于单基因疫苗;口服人乳头病病毒18E7与次级淋巴组织趋化因子联合基因疫苗,该联合疫苗使荷瘤鼠瘤重降低,生存率延长,其发挥的抗肿瘤作用可能可增强体液免疫和细胞免疫应答。9.2.7基因修饰疫苗印记基因PEG10修饰的树突状细胞(DC)疫苗,制备的DC疫苗能有效激发特异性CTL应答,并对HepG2肝癌细胞有明显的杀伤毒性;GM-CSF修饰肿瘤细胞疫苗(GVAX),肺癌患者85例治疗后Treg比例下降,提高其疗效和预防都较好;新型树突状细胞疫苗,成功构建了可同时沉默SOCS1、HMGR1刺激和肿瘤相关抗原负载的新型DC疫苗;树突状细胞疫苗,人外周血单核细胞用rhGM-CSF、rhIL-4、rhIL-2和IFN-γ诱导扩增,CEA相关多肽致敏,该DC给晚期胃肠道恶性肿瘤患者回输后1个月、3个月,患者的细胞免疫CD4、CD8和体液免疫IgG、IgM显著提高,IgA有一定提高;携带HPV16E6E7基因的重组腺病毒感染DCs制备基因修饰DC疫苗,该DC具有杀伤子宫颈癌CaSki细胞的作用;IL-18基因修饰的成熟树突状细胞疫苗,对卵白蛋白诱导的哮喘小鼠气道炎症具有一定的预防作用;IL-2膜表面修饰MB49细胞疫苗,用蛋白膜锚定技术,该疫苗既可保护IL-21生