食品微生物学检验中的质量控制

食品微生物学检验中的质量控制

微生物具有小型、广泛的分布、快速繁殖和代谢强度高的特点。食品从原辅料采购、储存、生产到消费的各个环节都可能受到微生物的污染,引起腐败和带毒,导致食用者发生食物中毒。还可能通过食品传播疾病微生物,导致食品安全性受到影响。在我国正全面实施的食品质量安全市场准入制度,也把菌落总数和大肠菌群(有微生物检验项目)明确列为企业出厂检验项目和有关行政部门监督检验项目,以便监控生产,保障消费,为社会提供安全的食品。虽然菌落总数和大肠菌群检测的国家标准GB/T4789.2-2003和GB/T4789.3-2003对检验方法、步骤等作了具体的规定,但仍有一些内容并没有具体说明,致使很多企业检验员在实际检测过程中存在一些疑惑问题,笔者提出的菌落总数和大肠菌群检验过程质量控制的要求,可有效地解决目前实际检测中存在的问题。1控制细菌总数和大肠杆菌群质量的基本要求要确保菌落总数和大肠菌群检验结果的正确,检验人员的素质、仪器设备、药品与培养基、检验环境、采样、样品预处理、检样稀释应满足基本要求。1.1规范的检验检测活动食品微生物学检验人员首先必须具有多方面的专业技术知识。第一,具备食品微生物学理论知识和检验技术,且经过考核通过后才能上岗;第二,掌握与食品卫生有关的法律、法规,能正确理解各种标准的实用范围、对象;第三,熟悉计量学的基本知识以及检验仪器设备使用和鉴定制度,能够正确使用法定计量单位;第四,了解食品工艺学的知识,能得心应手地处理由微生物引起的问题。此外还应具有:严肃认真的工作态度、精密细致的观察和熟练规范的操作、实事求是的科学态度和良好的职业道德;有将无菌操作贯穿于整个检验过程的意识。目前,由于不熟悉或不能正确理解相关知识,造成检测错误或不能正确处理有关问题的现象相当普遍。1.2常用的动物界面设备微生物学检验室必须配备能够满足菌落总数和大肠菌群检验工作精度需要的仪器、设备及设施,如生物显微镜、培养箱、干燥箱、高压蒸汽灭菌器、无菌室(或超净工作台)以及常用的玻璃仪器。所有的仪器和设备均应按照生产厂家提供的方法和有关规定正确使用。计量器具如天平、高压蒸汽灭菌器的压力表、干燥箱及培养箱的温度计应鉴定合格,并在有效期内使用,计量器具的台帐、送检和使用记录齐全。常用的贵重仪器和设备,使用前应检查,使用后要登记,要做到定期检修,以保证仪器、设备处于良好的工作状态。1.3干法培养基的溶解菌落总数和大肠菌群检验用的培养基、染色液及其他试剂应严格按照GB4789.28-2003规定的方法进行操作。目前菌落总数和大肠菌群检验用的培养基都可以从专业商店买到,这些干粉培养基必须是专业厂家生产的合格产品,其理化指标可以从以下几个方面进行初步检查:疏松颗粒或粉末状;颜色正常一致;溶解后无沉淀;pH值为7.2±0.2(45℃时)。干粉培养基易受潮变性是需要引起重视的一个主要问题,为此使用时应尽量缩短开盖时间,加强包装的密封性能,一般干粉培养基放在低温干燥的环境中保存。制备培养基时应注意:必须在玻璃容器、搪瓷缸或铝锅中进行,如用铜、铁器皿,会对微生物生长有毒害作用;培养基配制最好用蒸馏水,避免使用自来水,因其中含有氯等抗菌物质;干粉培养基一定要完全溶解后才能分装;由于配制水分不同或启用次数、时间增加,干粉培养基的pH值可能会有所变化,应随时加以调整。另外制备好的培养基应及时灭菌、使用,如无特殊需求,使用不完的可室温保存(夏天最好放在冰箱内冷藏),并在2周内用完,有长菌、干裂或产酸、产气等现象或被污染迹象的则不能再使用。1.4做好微生物检验室和无菌室的准备工作菌落总数和大肠菌群检验均需在无菌室(或超净工作台)内进行,既不能让微生物散布出去,又必须使样品不再受污染。无菌室应有套间或缓冲间,最好设置推拉门,以防空气震荡太大。微生物检验室应备有脚踩式洗手池和固定的消毒设施。微生物检验室应制定完善的卫生管理制度:工作人员必须坚持每天做好环境卫生工作,并采用湿式保洁,防止灰尘飞扬,定期对操作环境进行消毒;对经培养后的培养基、培养液、用过的检样及其他废弃物,应投入指定的容器内,经无害化处理后方可排放,禁止乱扔,以防某些病原微生物散布;检验人员的工作衣、帽、鞋、口罩等灭菌后备用。每次实验前,无菌室应灭菌,通常的方法是紫外线照射15～20min后,喷雾5%石炭酸即可,如用超净工作台,需提前半小时开机;工作人员进入无菌室后,在实验没完成前不得随便出入无菌室。1.5样品的制备和贮藏整批食品的菌落总数和大肠菌群状况是通过对样品的检验来评价的,因此,采样是十分重要的。采集食品样品的过程中应注意以下3个问题:第一,采样工具和容器宜选用耐消毒灭菌的材料,如玻璃、陶瓷、搪瓷、铝、不锈钢、牛皮纸等,使用之前应进行认真清洗、干燥和相应的灭菌处理(湿热灭菌121℃,20min,干热灭菌160～170℃,1～2h),采样工具和容器不能用消毒剂消毒,样品中也不能加入防腐剂,以免影响检验结果的正确性;第二,在严格无菌操作的条件下,按GB4789.1-2003的样品采集方法和数量均匀而准确地取样,如为散装样品,应及时封口,使样品具有代表性,若所取样品没有足够的代表性,检验结果则不能反映整批食品的卫生状况;第三,每件样品需贴上标签,做好标记(如品名、来源、采样地点、采样人及时间),及时送检。1.6样品的重量法和体积法检验室在收到送检单和样品后,应立即登记,填写序号,并按检验要求,及时准备条件、组织力量进行检验。样品如放在冰箱冷藏(1～5℃)存放,冷冻食品需保持冷冻状态,勿将不需冷冻的样品冷冻保存,以避免冻结,使细菌遭受破坏。首先确定检验时用重量法还是用体积法。一般固态样品宜用重量法,液态样品宜用体积法,但对于黏性液体(如酱类),如用体积法,在吸管上会黏附一定量的样品,因此最好用重量法。样品在打开包装前,都要在取样开口处的周围表面用75%酒精棉球擦拭消毒,避免引起样品污染。对于冷冻饮品如冰激凌、速冻预包装食品,可放在灭菌容器内,置45℃水浴锅熔化,熔化时间不应超过30min,如熔化时间过长,会导致细菌增殖,使实测结果偏高;对于酸性(如食醋)样品,应用灭菌的20%～30%碳酸钠溶液调至中性,否则使不适合酸性状态下生长的细菌受抑制;充气饮料应在无菌条件下进行排气,未经排气的会使样品接种量偏低;含盐量较高的样品应用灭菌蒸馏水进行稀释,如高盐样品仍用生理盐水进行稀释,使不适于高盐状态下生长的细菌受抑制,结果会比实测值偏低。1.7固体菌悬液的制备菌落总数和大肠菌群检验中都涉及到检样稀释,通常采用10倍稀释法。无菌操作将25mL(g)样品,放入225mL稀释液(瓶内预置适当数量的玻璃珠,固体样品应在灭菌乳钵内充分研磨后加入)中,振摇10min,可制成均匀的菌悬液,固体样品如无研磨,可用均质器以8000～10000r/min的转速处理1min。如固体样品不均匀,稀释液未充分混匀,会使所测结果准确度降低。在作进一步稀释时,吸管插入样品或稀释液中应深浅一致,否则会影响检验结果;吸入液体后,应沿管壁慢慢注入递增的稀释液中,特别注意此时吸管尖端切不可碰到稀释液,另外,每递增稀释一次,应换用一支1mL灭菌吸管。2总结法的质量控制菌落总数测定的国家标准方法为标准平板培养法。2.1设置连续稀释度不同的食品其“菌落总数”的检出限量不一致。稀释度的选择常以国家卫生标准及经验为依据,一般选择2～3个连续稀释度,但应基本保证其中一个稀释度所生长的菌落在30～300。酱油、奶制品、肉制品等细菌含量一般较高,稀释度可相应选择较大的,如10-2、10-3及10-4等,而饮用纯净水、饮料、糕点类样品中细菌量较低,稀释度应选择较小的,如液体样品可选100(原样)、10-1,固体样品选10-1、10-2等。2.2检样、稀释液与培养培养基相结合时稀释液1mL加入培养皿后,应在尽可能短的时间内倾入营养琼脂(营养琼脂温度应保证在45～50℃之间,温度过高,易杀死细菌,温度过低,会提前凝固),并立即在桌面上推旋培养皿,使检样、稀释液与培养琼脂混合均匀,切忌推旋动作过大,将培养琼脂溅到培养皿盖上,影响测定结果。凝固后立即倒置于培养箱内培养,这样可避免冷凝水污染菌落或菌落蔓延生长而难以计数,同时应用无菌水或无菌生理盐水作空白对照,如果在空白对照中检出细菌,则可认为培养基、培养皿或吸管在操作过程中存在污染情况。另外,整个检验过程应避免在日光直射下进行,以防强烈的日光将细菌杀死。2.3计数稀释度的测定样品在36±1℃培养48h后应及时计数,填写原始记录表(如表1)。表头注明样品名称、检验日期。计数稀释度的选定应按标准,计算菌量时应减去空白。菌量如在100以内,按实有数报告,大于100时,用科学计数法,以N×10n表示,N为两位有效数字。3肠菌组检验的质量控制大肠菌群测定的国家标准方法为三步法,即乳糖胆盐发酵试验、分离培养和证实试验。3.1加样量的确定在进行产品检测前,首先应根据产品标准选择适宜的检样量。我国的大多数食品卫生标准中大肠菌群要求≤30(或更大)MPN/100mL(g),应选择检样量为1mL(g)、0.1mL(g)、0.01mL(g);少数食品卫生标准中大肠菌群要求≤3(如饮用纯净水)或≤6(如饮料)MPN/100mL(g),检样量则为10mL(g)、1mL(g)、0.1mL(g),这里检样量是指在乳糖胆盐发酵试验时,加到管中原样品的mL(g)数,并非样品稀释后的mL(g)数,注意每一个稀释度应接三管。接种量在1mL(g)以上,用双料乳糖胆盐发酵管,接种量在1mL(g)及以下,用单料乳糖胆盐发酵管。乳糖胆盐发酵(初发酵)试验的结果判定,只有既不产酸又不产气的管可判定为大肠菌群阴性。初发酵阳性管,不能直接判定大肠菌群阳性,只能经过平板分离和证实试验后,才有可能判定是否为阳性。原因是乳糖胆盐发酵试验是样品发酵结果,由于选择性试剂胆盐的局限性,有可能存在由非大肠菌群发酵乳糖产酸产气。所以只作一步初发酵,就作判定,会导致相当部分的合格产品被作为不合格样品处理,应予注意。在实际工作中,遇到初发酵试验时产酸,无气体产生或倒管内存有极小气泡(有时比小米粒还小)或倒管内无气体,但在液面及管壁却可看到小气泡,这是因为倒管管口的完整情况与倒管外有无沉渣均可影响产气反应的观察,管口不完整有利于气体进入倒管,管口周围有沉渣能阻碍或延缓气体进入,这种情况的发酵管阳性检出率可达半数以上,因此遇到上述情况应作初发酵阳性管处理。3.2菌落的拉入量:大肠菌群的制备利用伊红美兰平板从初发酵阳性管中分离培养为确证试验提供菌源。培养时间控制在24h内,需仔细观察菌落特征,一般来说,在伊红美兰平板上大肠菌群可疑菌落特征有四种情况:紫黑色,有金属光泽;紫黑色,无金属光泽;红色,中间颜色较深;粉红色菌落。这四种菌落,大肠菌群的可疑程度从高到低。因此,挑取菌落与大肠菌群的检出密切相关。挑取菌落时要挑取可疑程度高的菌落,对于可疑程度低的菌落则应多挑几个(一般为2～3个),以免出现假阴性。挑取的菌在进行革兰氏染色时应注意:涂片薄而均匀;染色与乙醇脱色时间应严格控制,一次处理载玻片以2～3片为宜,以免脱色时间过长影响结果的判定。只有同时满足革兰氏阴性、无芽孢杆菌和复发酵试验产酸产气两个条件才能确定该发酵管为阳性,其他结果仍判定大肠菌群阴性。3.3原样品的mlg测定根据上述对各管大肠菌群阳性或阴性的判定结果,查MPN检索表确定检样中大肠菌群最可能数,应注意MPN检索表第