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DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验原理

DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子片段的大小、构象不同，移动速度也不同，所以可将大小不同或构象不同的DNA分离。1.0%的琼脂糖适合分离约0.5-7kb的核酸分子。最常用的缓冲液是pH8.3的TBE缓冲液（0.89mol/LTris-Acetate和0.002mol/LEDTA）电泳过程中需要使用指示剂指示核酸迁移的情况，常用的指示剂为溴酚蓝（Bb，蓝紫色）。它分子量仅670，可自由通过分子筛，近似于自由电泳，在不同浓度的胶中迁移速度基本相同。按所需分离的核算分子的大小，可以根据指示剂迁移情况来决定电泳的时间。1.0%的琼脂糖凝胶中，0.6kb的双链DNA片段与Bb迁移速度大致相同。还需要加入蔗糖或甘油来增加比重，使样品能沉入胶孔。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA用溴乙啶EB染色后能显示出条带。溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在紫外光照射下，呈现橙黄色（波长590nm）的荧光。染色液可在电泳结束后进行，也可在电泳前加入，并且因为EB-DNA复合物荧光强度比EB本身强很多倍，一般无须洗去就能观察到核酸电泳带。二、试剂与材料1、1.0%琼脂糖：1g溶于100ml缓冲液中加热溶解。2、pH8.3,Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TAE）3、标准DNA溶液4、10mg/ml溴乙啶染色液（EB）5、电泳板电泳槽6、移液枪吸头等7、玻璃制品三、操作方法

1.0%琼脂糖凝胶板的制备：称取1g琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mlpH8.3TAE缓冲液，加热使充分溶解。取出自然冷却至60°C左右，加入10mg/mlEB

5μL，混匀后倒入已放置梳子的电泳板，室温冷却放置45min左右，待凝固垂直拔出梳子。预电泳：将制备好的凝胶板进入电泳槽中，3-5mA/cm预电泳30min。加样PCRmarker：1μLmarker+1μL加样缓冲液+4μLTAE混匀加入孔中PCR样品：5μL样品DNA+1μL加样缓冲液混匀后一次加入孔中电泳接上电源电压120V电流50mA进行电泳

结果观察戴上手套取出凝胶板，沥去残留液体，倒扣在紫外灯上观察结果。荧光强弱由DNA含量决定，而DNA迁移率则反映了DNA片段的大小。四、注意事项溴乙锭是致癌物，操作时戴防

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