质粒提取原理及碱法

质粒提取原理质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）:质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（1DNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型。质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为:松弛线性的DNA；松弛开环的OC构型；超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料漠化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。道中的SCDNA走在最前沿，OCDNA则位于凝胶的最后边；道中的LDNA是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OCDNA和SCDNA之间。质粒小量提取之碱裂解法试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入PH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。试验准备：1、 溶液I:pH8.0GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA,25mmol/LTris—HCl）；溶液I可成批配制，在10lbf/in2（6.895x104Pa）高压下蒸气灭菌15min,贮存于4P。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。2、溶液II：0.2mol/LNaOH（内含1%的SDS），这个用的时候需现配。要新配置溶液II是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4NNaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…日+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。3、溶液III：pH4.8乙酸钾溶液（60ml5mol/LKAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L.pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS一蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。4、异丙醇；采用PEG(6000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1%左右，小分子所需PEG浓度高达20%。5、 无水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。加入的乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。也可改用95%乙醇来替代无水乙醇。但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15—30min即可。但因为使用异丙醇时常把盐沉淀下来，所以较多的还是使用乙醇。6、pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTris—HCl，1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20ug/ml。在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下(pH5〜7）,RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。7、70%乙醇试验步骤：1、无菌操作台上，取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上以10000rpm离心1min，或者以4000rpm离心5—10min,弃上清液，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。2、 沉淀中加100pl用冰预冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要剧烈振荡）。室温下放置10min。3、 加入200pl溶液II（新鲜配置），加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5min。4、加入150pl预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴15min。5、微量离心机上以4°C，12000rpm离心15min，取上清液于另一新Eppendorf管中。6、上清夜中加入等体积酚/氯仿（1：1）混匀，微量离心机上以4C，12000rpm,离心5min。｛经验之谈：如果选用宿主合适的话（如DH5a、XL1-blue等，HB101和BL21则不行），可以不用酚氯仿抽提这一步。用1倍体积的乙醇沉淀，沉淀中所含的盐和RNA就很少了，完全去除上清液后就可以直接加TE溶解质粒，后续的限制性酶切、转化完全没有问题。仅供参考｝7、小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下层的有机相。8、小心移出上清于一新Eppendorf管中，加入2/3倍体积异丙醇，混匀，4°。离心

12000gX5min。9、上清夜中加入2倍体积的无水乙醇混匀，室温下放置5min—10min，以12000rpm，离心5min-15min。10、1.0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1〜2次,沉淀在室温下晾干。11、小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。再将附着在管壁上的液滴除去。在除去管壁上的液滴时，可以用一次性吸头与真空管相连，用吸头接触液面。但在液体吸出时应当尽量使吸头远离核酸沉淀。自然干燥或者真空抽干到看不到液滴最好。12、加入50p1TE缓冲液(PH8.0含20pg/mlRNaseA)溶解质粒粗提物，在-20°C保存。注意事项：提取过程应尽量在低温环境中进行，蛋白质的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提尽量将蛋白质除