冰冻切片漂片

1/8免疫组化步骤：将脑片放到，6孔板〔12孔板〕，3%双氧水封闭10min〔PBS洗一遍〕；〔二抗不同，操作步骤有差异〕，本试验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片四周的水用吸水纸或卫生纸擦净，留意不要遇到脑片；然后依据一抗说明书，将一抗按比例稀释，参加稀释后的一抗，一般，大5030微升；留意不要让液体流到边上；假设流到边上，要重加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜〔18h24h〕，37℃；然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。DAB配方为：10mgDAB20ml0.01MPBS100-20030%双氧水，留意避光。10min3分钟显色就20分钟仍未显色，则看下面的参考。PBS2-3h，潮湿天气3-4h。3min，100%3min，100%酒精2min2min3-5min70%酒精前在双1min。免疫荧光步骤及留意事项：1620-40min；〔假设是从切PBS洗一遍〕2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片四周的水用吸水纸或卫生纸擦净，留意不要遇到脑片；3，然后依据一抗说明书，PBS50微升一30微升；留意不要让液体流到边上；假设流到边上，要重加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4，4℃，过夜〔18h24h〕，不37℃4872小时；5，然后，PBS洗净两——2小时。留意避光操作。6，0.01MPBS洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干；7，滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观看。常见问题：1，荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗次数过pH不适宜；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过低或过高；激发波长不在抗体适用波段。2，背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底；封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显微镜荧光强度过强。总之试验是宠爱强阳性，不宠爱假阴性，呵呵。任何试验都需要花时间摸索才能找到其最正确的工作条件。另附免疫组化常见问题解析。原理是一样的，只是最终的显色方法不一样，有些问题有启发作用。免疫组织化学边缘效应?缘由:1〕组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂移在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致.解决方法：制备优质的胶片〔APES或多聚赖氨酸〕，切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应标准，尽量避开选用坏死较多的组织。2〕切片上滴加的试剂未充分掩盖组织，边缘的试剂简洁首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决方法：2mm。用组化笔画圈时，为了避开3-4mm。产生组织切片非特异性染色的缘由有哪些？如何解决？抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。解决方法:这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来掌握。这是最重要的一条。一抗用多克隆抗体易消灭非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高〔含血细胞多的组织〕，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；DAB孵育时间过长或浓度过高；PBS冲洗不充分，残留抗体结果增加着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；做出阳性结果？另外不是抗体浓度越高就越易消灭阳性结果，抗原抗体反响有前带和后带效应，必需摸索最正确浓度。2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必需用充分抗原修复来翻开抗原表位，以利于与抗体结合;4次*6min试试。有人做过试验，这是最正确的时间和次数。假设不行，还可高压修复。3、组织切片本身这种抗原含量低；4、血清封闭时间过长。5、DAB孵育时间过短。6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反响。7、开头做免疫组化，我建议你肯定要首先做个阳性比照片，排解抗体等外的方法问题。背景强的缘由?1,考虑一抗浓度高；2,DAB孵育时间；3,也要考虑4,适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。DAB3-1040秒就够了，再多本底就太深，现在3分钟也不出，真的有必要延长显色时间吗？DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下掌握显色时间，到消灭浅棕色本底时即可冲洗；DAB显色时间很短〔如几秒或几十秒〕就消灭很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，假设很短时间就消灭背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长〔如超过十几分钟〕才消灭阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短〔4度过夜〕；另一方面就是封闭时间过长。石蜡切片在染色过程中消灭脱片现象？，1烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度二，用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购置到或这自己做PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织，四，用高温修复时，温度骤冷也可能引起。年前爬的细胞片在-20度放了半年〔保鲜膜密封〕，现在取出来再作，做了两次，步骤均是按以前的作的，但今日做时，原来显色很强的片子现在显色很弱了，问什么呢？是不是片子放的时间太长了？抗体在4度放的时间也不长而且这次浓度比以前做的还高?首先，抗体浓度和孵育时间在免疫组化中至关重要。在抗原抗体反响并非抗体浓度越高，反响越猛烈，这叫前带现象。所以选择最正确的一抗浓度和孵育条件也是格外重要的，其实抗体浓度过高或过低均会引起阴性。我到认为你这片子的影响可能更大。尽管在-20度保存，但是时间一般超3个月就不能保证其中抗原的丧失，建议可以重爬片，以排解方法和抗原的缘由。4度保存是指未稀释还是稀释后抗体，存放多长时间？一般稀释后抗体不能保存很长时间的。为什么切片倾斜，抗体分布不均匀，就会造成一半阳性，一半阴性？我认为，即使切片倾斜，抗体掩盖少的那局部组织和其他局部抗体的浓度是一样的，只是抗体体积的大小差异！假设说抗体倾斜没掩盖好的地方是阴性，那为什么不是干片所导致的非特异性高背景的染色呢？当切片倾斜到有一半甚至都没液体时，就会消灭阴阳脸样的着色。你认为呢？高温抗原修复后就没必要灭火内源性过氧化物酶?POD已经灭活PODDAB发生氧化复原反响DABPODDAB反响POD，尽可能消退非特异性着色。冰冻切片有时会有小洞?冰冻切片有时会觉察切片上会有空洞，这是由于组织在冰冻过程中形成冰晶，形成冰晶的缘由一是组织冰冻时间太慢，或者冰冻的温度不够低，渐渐形成冰晶，二是有些组织在冰冻之前需要做适当的固定，如脑组织，然后放入30%4度冰箱过夜以削减冰晶形成，并且能最大程度保持组织细胞形态。37度速融，否则易造成组织块的破坏。常用免疫组化结果分析方法?1.40*10个视野，人3~6张性范围进展评分〔1~40~25%、26~50%、51~75%、76~100%〕，最终可以分数相加，再进展比较。对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。12.DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色？阳性标记可以从色度特征，阳性标记细胞学特征来进展根本的推断。色度特征：一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。依据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱抗原；棕黄色，提示为中等度抗原；棕黑色，示为强抗原。在结果推断中，后两者较有意义，可作为推断依据。细胞学特征：阳性表达必需在细胞特定的抗原部位，假设不在抗原所在部位的阳性表达即,复合型几种。这是需要结合背景学问的。同样，非特异性染色也有肯定的特点：它首先是指抗原无明确定位，各种细胞累及一片，色度无深浅之分，这种标记组织片不能作为免疫组织标记结果推断的依据，造成非选民性染色的缘由常为组织标本固定不佳，抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不标准等。因此，免疫组化特异性染色定位格外重要，一般状况下，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。假设缺乏细胞音的不均一性染色，即或呈阳性染色，常提示为非特异性染色。另外，组织片边缘反响和出血坏死灶四周阳笥反响不能作为诊断依据。13.1.石蜡切片在染色过程中消灭脱片现象？我用组织芯片和一般切片在多种条件下进展了抗原修复试验，觉察在热修复后，组织脱片最主要缘由是组织脱水不良，肿瘤组织黏附性差在小块组织时也简洁撕脱〔减小热修复加热功率，PBS冲洗时不要直对组织冲洗、可以有效防范〕。DAB显色后觉察切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？这就是免疫组化染色的阴阳脸，免疫组化试验是环环相扣的试验，任何一步试剂孵育不全〔没有均匀的在组织上孵育〕都可能导致这样的结果。免疫组化结果老是消灭阴性结果？那就要考虑真阴性还是假阴性！假阴性是你操作不当或者试剂质量的问题了。切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？你的抗体是否特异，孵育时间温度浓度是否过长！437度复温，目的是什么？我没遇到这样的说法，是否是想加速复温？还有我不知道国内的院校为什么对37℃孵育37℃外，其37℃中孵育。免疫组化中抗原修复的最正确条件是什么？尤其微波修复。抗原修复没有什么最正确条件只有可能管用的修复条件。tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？tritonX100是脂质溶解剂，做免疫细胞化学时细胞膜是完整的半透膜，孵育的抗tritonX100来破膜。石蜡切片细胞多数是切开状态了。triton。苏木素复染的时间应当是多少？复染过度咋办？要看你是用什么苏木素，HE，它只要一般的稍微染色就