乌司他丁对失血性休克大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

乌司他丁对失血性休克大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

动脉供血培养（i.ri）是术后肝功能衰竭的重要原因之一。本实验通过建立大鼠失血性休克模型,探讨乌司他丁(UTI)对失血性休克大鼠肝脏再灌注损伤的保护作用及机制。1材料和方法1.1动物模型的建立雄性Wistar大鼠24只,鼠龄10～12周,体质量210～250g,由重庆医科大学实验动物中心提供。UTI产自广东天普生化医药股份有限公司。TUNEL凋亡试剂盒购自美国Roche公司。TNF-αELISA检测试剂盒购自武汉博士德公司。MDA、SOD测试盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。髓过氧化物酶(MPO)测试盒购自上海沪峰生物科技有限公司。1.2动物模型的建立与分组24只Wista大鼠随机分为3组,每组8只,分别为假手术组、生理盐水治疗组(NS治疗组)、UTI治疗组。动物模型的建立参照文献,大鼠用2%戊巴比妥钠(3mL·kg-1)腹腔注射麻醉,手术分离右颈总动脉并置管用于监测平均动脉压,分离左后肢股动脉、股静脉并置管分别用于放血、给药及血液回输。手术后静脉推注肝素钠(1000U·kg-1)使大鼠全身血液肝素化,连接多道生理记录仪监测平均动脉压、心电图和肛温。待血压稳定后自股动脉快速放血(1.3mL·min-1·kg-1)至平均动脉压40mmHg,再通过慢速放血将平均动脉压维持20min后放置60min,整个放血过程大鼠共失血45%左右。维持1h后,(1)UTI治疗组:予乌司他丁25000U·kg-1(2mL生理盐水稀释)静脉推注(5min内),并回输放出的血液和等量生理盐水,速度<2mL·min-1,在30min内完成液体复苏;(2)NS治疗组:则予2mL生理盐水静脉推注,余同UTI治疗组;(3)假手术组:除不放血和输液外,其他处理与模型相同。观察3h后处死大鼠。取血液离心分离血浆;取肝右叶2块肝组织,1块以4%甲醛固定用于组织病理检测;1块制作10%肝组织匀浆,离心取上清液。1.3mda、sod、mpo含量测定肝功能酶学指标采用全自动生化分析仪测定;TNF-α采用ELISA法检测;肝组织MDA、SOD、MPO含量的测定参照相应的检测试剂盒说明进行检测;固定好的肝组织石蜡包埋切片,进行常规HE染色和TUNEL法染色,观察肝组织病理改变及肝细胞凋亡情况(以肝细胞凋亡指数表示并进行半定量分析)。1.4统计处理采用SPSS11.0软件进行统计学分析,数据用表示,组间差异行单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1中央静脉周围肝窦血清学变与假手术组相比NS治疗组肝组织损伤最重,可见肝细胞水样变,肝窦淤血变窄,间质大量炎性细胞浸润,尤以中央静脉周围肝细胞、胆管上皮细胞损伤为重。UTI治疗组较NS治疗组损伤轻,肝细胞轻度水样变,少量炎性细胞浸润(图1)。2.2各组小鼠血清中mm2的表达情况UTI治疗组凋亡肝细胞数为(20.0±3.2)/mm2,明显低于NS治疗组(40.0±8.2)/mm2(P<0.05),但均明显高于假手术组(5.0±0.5)/mm2(P<0.05,图2)。2.3两组患者ul-1、nl-1,3.32.3333333333333333.34.3.3.3.3.3UTI治疗组血清ALT、AST活性和TNF-α水平分别为(217±45)U·L-1、(460±85)U·L-1、(1.3±2.3)ng·L-1,显著低于NS治疗组(P<0.05),但均明显高于假手术组(P<0.05,表1)。2.4nmolmg-1和ug-1的比较UTI治疗组肝组织中MDA浓度、MPO活性分别为(1.24±0.11)nmol·mg-1和(1.22±0.12)U·g-1,明显低于与NS治疗组和假手术组;SOD活性为(0.65±0.05)kU·mg-1,高于NS治疗组,但低于假手术组,差异均有统计学意义(P<0.05,见表1)。3各次输注时肝脏组织抗氧化活性的变化血清ALT、AST是反应肝脏损伤的重要酶学指标。本实验中,NS治疗组失血性休克大鼠在输注自体血液复苏后3h导致血清ALT、AST活性显著升高,而且肝脏发生明显组织病理损伤,说明大鼠失血性休克后输注自体血液复苏对肝脏造成了I/RI。与NS治疗组相比,UTI治疗组大鼠血清ALT、AST显著降低,肝脏病理损伤减轻,说明UTI对失血性休克再灌注后肝组织损伤具有保护作用。脂质过氧化物最后裂解终产物MDA是目前公认的能反映氧自由基产生及引发脂质过氧化反应的间接指标,其含量变化不仅可反映体内氧自由基生成与否及脂质过氧化反应强烈程度,尚可反映其造成组织损伤的严重程度。内源性清除氧自由基物质SOD活性可准确反映体内氧自由基量。MPO是存在于中性粒细胞内的一种耐高温酶,其活性与中性粒细胞在组织中浸润程度成正比。UTI治疗组肝组织MDA、MPO浓度比NS治疗组显著降低,SOD活性显著升高,说明UTI在肝组织有效地抑制了中性粒细胞的浸润程度、脂质过氧化反应的强度。在肝脏I/R早期,细胞凋亡参与I/RI。TNF-α是凋亡诱导因素之一,可通过神经酰胺信号途径触发细胞凋亡。本实验发现,UTI治疗组的肝细胞凋亡数和血清TNF-α水平较NS治疗组明显减少,提示乌司他丁可以通过减少肝脏I/RI后肝细胞凋亡发生发挥保护作用。综上所述,UTI对失血性休克大鼠肝脏再灌注损伤的保护作用可能存在以下机制:(1)可能与其抑制中性粒细胞浸润,进而减轻中性粒细胞造成的蛋白水解酶释放、抑制炎症介质释放、预防细胞因子级联反应的作用有关;(2)作为一种膜稳定剂,UTI能抑制氧自由基生成,清除氧自由基,从而增加肝细胞膜及溶酶体、线粒体、内质网等细胞器的稳定性,减轻氧自由基引起的损伤;(3)UTI的抗凋亡作用可能也参与对肝脏再灌注损伤的保护作用。本实验虽在大鼠活体内证实了UTI对肝脏再灌注损伤的保护作用,但在UTI治疗的再灌注肝组织内仍有较多炎