海带渣固体发酵产植物激素6-糠氨基嘌呤的研究

海带渣固体发酵产植物激素6-糠氨基嘌呤的研究

传统农业主要依靠化学农药和化学肥料的使用。为了在高产生产中取得成功，农业生产者经常使用化学农药和化学肥料，导致化肥和土壤肥力不足、土壤养分失衡、土壤侵蚀、土壤侵蚀、，河流和地下水污染等问题。为了自身改善，减少了对外部不利条件的抵抗力，并影响了我国农业的可持续发展。与此同时随着人们对食物品质要求的提高,以及对有害生物综合治理与有害生物生态治理认识的加强,现在科研工作者越来越多的把目光投到植物与微生物之间的作用,以及植物与其所在生态环境中的各个因子之间的相互作用上,因此分离筛选具有多种PGPR特性的微生物肥料菌株,成为广大微生物科研工作者的研究重点。微生物肥料的应用也已被证明是农业可持续发展的有效途径,是生产绿色食品的重要内容.目前微生物肥料在多种作物上得到广泛应用,并取得了良好的经济效益、社会效益与生态效益。海带是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物,它含有许多陆生植物不具有的碘、钾、镁、锰和钛等微量元素以及海藻多糖、甘露醇等。有研究证明,海带中含有大量的高活性成分和天然植物生长调节剂,可刺激植物体内非特异性活性因子的产生,能促进作物生长发育,提高产量。目前我国的海带加工主要是提取碘,这个过程同时会产生大量的废弃物海带渣。海带渣中的主要成分为海藻纤维、蛋白质、海藻多糖、壳聚糖、多酚和甜菜碱等,现阶段除了部分作为饲料使用,大多都当作工业垃圾处理了。利用海带渣生产有机肥,生产有机燃料,等,不仅可以减少对环境的污染,还能充分利用其中多种未被利用的营养物质和活性成分,有效地变废为宝。响应面分析法是20世纪中后页发展起来的优化实验条件的统计学方法,能用较少的实验数据推算出目标值的优化条件,优化效果好,在微生物发酵方面已经得到了广泛的应用。本研究旨在通过对一株具有潜在应用价值的枯草芽孢杆菌菌株进行海带渣的固体发酵,研究其以海带渣为基本培养基进行固体发酵的特性,通过单一因素实验和响应面实验进行产抑制寄生曲霉活性物质的发酵条件优化。1材料和方法1.1曲霉突变菌株的分离培养实验室分离得到的具有应用潜力的生防枯草芽孢杆菌JGA2(-5)27-2;能积累红色黄曲霉毒素中间产物的NA突变寄生曲霉突变菌株;GY固体培养基:20g/L葡萄糖,5g/L酵母粉,20g/L琼脂;GY液体培养基:20g/L葡萄糖,5g/L酵母粉。海带渣、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、酵母粉、牛肉膏、NaNO3和(NH4)2SO4、NH4NO3等。1.2高效液相色谱法检测高效活性接种母液:将试管斜面上的生防枯草芽孢杆菌JGA2(-5)27-2取一环接种到装有20mLGY培养液的三角瓶中进行35℃,150r/min,条件下的摇床培养,培养12h。海带渣的固体发酵:对海带渣进行粉碎(0.5mm);采用培养瓶进行海带渣的固体发酵,每个培养瓶中装40g干海带渣与60mL的去离子水,pH值为自然,灭菌。按照4%的接种量(4mL)将接种母液接种到灭菌后的固体培养基中进行固体发酵。发酵温度为35℃,发酵时间为9d。发酵产物pH值的测定:取5g发酵产物到装有50mL蒸馏水的三角瓶中,充分振荡2到3min,静置1min后用pH计对液体的pH值进行测定。海带渣固体发酵产物水提取液:取5g发酵产物到装有45mL蒸馏水的三角瓶中,振荡30min,10000r/min转离心15min,取上清,用0.22μm微孔滤膜过滤,过滤液备用。96孔板检测对寄生曲霉的抑制活性:实验采用96孔板微培养来对发酵产物水提取液的抑制寄生曲霉的活性进行检测。先在96孔板的每个孔中加60μLGY固体培养基,然后将各处理的提取液(或者稀释后的提取液)按照60μL的量添加到孔中,每个处理3个重复,每个孔中接种5μL寄生曲霉孢子。将96孔板放置培养箱中进行28℃条件下的保湿培养,培养4~6d后观察每个孔中寄生曲霉的生长与产红情况。对96孔板分析不能得到较好结果的需要进一步的采用Tip-culture法进行定量分析。植物激素细胞分裂素的测定:利用高效毛细管电泳法对发酵产物水提取中的植物激素细胞分裂素进行检测。电泳操作条件如下:未涂层石英毛细管(50μm×57cm,有效检测长度48cm);运行缓冲液20mmol/L硼砂缓冲液(pH9.0);20mmol/L磷酸二氢钠溶液;检测波长200nm;分离电压20kV;温度28℃;重力进样20s(高度10cm)。毛细管柱使用前用0.1mol/L的NaOH、水、电泳缓冲液分别冲洗1、2和3min。样品溶液的配制:将处理好的代谢物粗品用适量的甲醇溶解,并用0.22μm孔径的有机滤膜滤过,弃去初滤液,收集续滤液作为样品溶液碳源的优化:海带渣为基础培养基,含水量为60%。以海带渣为基础培养基,并分别添加2%的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉为外加碳源,以不添加任何碳源的海带渣基础培养基为对照。培养基灭菌后按照4%的接种量进行接种,35℃条件下分别培养3、6、9、12和15d后,取样检测活性。氮源的优化:在海带渣基础培养中分别添加酵母粉(20g/kg)、牛肉膏(20g/kg)、NaNO3(6g/kg)、(NH4)2SO4(6g/kg)、NH4NO3(6g/kg)为外加氮源,以不添加任何氮源的海带渣基础培养基为对照。培养基灭菌后按照4%的接种量进行接种,35℃条件下分别培养3、6、9、12和15d后,取样检测活性。培养时间的优化:以海带渣为基础培养基,并在其中添加2%的蔗糖为外加碳源,培养基灭菌后按照4%的接种量进行接种,35℃条件下分别培养3、6、9、12、15和24d后,取样检测活性。含水量的优化:以海带渣为基础培养基,含水量分别为50%、55%、60%、65%和70%,并在其中添加2%的蔗糖为外加碳源,培养基灭菌后按照4%的接种量进行接种,35℃条件下分别培养9d后,取样检测活性。培养温度的优化:分别在31、33、35、37和39℃条件下进行发酵,并对样本进行检测。接种量的优化:分别按照2%、4%、6%、8%、10%和12%的接种量进行接种,发酵后对所取的发酵产物进行检测活性。pH值的优化:分别用pH值为1.0、2.0、6.5、7.0、7.5和8.0的去离子水进行海带渣发酵固体培养基的配制,发酵后对所取的发酵产物进行检测活性。根据单因素实验结果,确定海带渣发酵过程中的关键性因素,并通过爬坡实验和响应面分析法进一步的对海带渣固体发酵的条件进行优化。2培养基活性的检测碳氮的优化:96孔板检测在外加不同碳源条件、不同发酵时间下海带渣固体发酵后产物水提取液的抑制寄生曲霉的活性(如图1)。每个孔中用移液枪加60μL2GY固体培养基,然后分别添加60μL不同碳源和不同培养时间下的海带渣固体发酵后的水提取液。CK-1、1-1、2-1、3-1、4-1和5-1分别为对照组、葡萄糖组、蔗糖组、麦芽糖组、乳糖组和淀粉组发酵3d后的所取样本的活性。X-2、X-3、X-4和X-5分别表示该组发酵6、9、12和15d后所取的样本的活性。实验结果表明,外加碳源能较好地提高海带渣固体发酵产物的活性,CK的所有检测中均产红,表明不加任何外加碳源的条件下海带渣固体发酵不能产生有效的抑制活性物质;在外加蔗糖的海带渣固体发酵条件下所产生的活性物质活性最强,蔗糖组的所以检测孔中均未产红。利用毛细管电泳法对常见的激素(植物生长素、细胞分裂素、脱落酸和赤霉素。植物激素细胞分裂素)进行检测,只有在外加蔗糖组中检测到了细胞分裂素6-糠氨基嘌呤的产生。氮源的优化:96孔板检测在外加不同氮源条件、不同发酵时间下海带渣固体发酵后产物水提取液的抑制寄生曲霉的活性。因96孔的检测结果不能明显的区别去最优的氮源,进一步用Tip-culture的检测法进行定量的分析。采用Tip-culture(400μL2GY+400μL海带渣发酵水提取液+5μL寄生曲霉孢子悬液)的定量的检测方法对发酵9d后的培养基的活性进行检测结果如图2所示。从左到右分别为GY组、CK组(未加外加碳源)、酵母粉组、蛋白胨组、NaNO3组、(NH4)2SO4组和NH4NO3组。各组中寄生曲霉的生长量为:0.0602、0.0400、0.0207、0.0136、0、0.0160和0g。利用毛细管电泳法对常见的激素进行检测,各个样本均未检测出植物生长素、细胞分裂素、脱落酸和赤霉素。发酵时间的优化:以外加2%蔗糖的海带渣固体培养基进行发酵培养,利用96孔板微培养进行活性的检测。96孔板微培养的结果表明:海带渣固体发酵9d后的样本的活性最佳。培养3、6、9、12、15和24d后海带渣固体发酵产物的pH值分别为7.66、8.07、8.20、8.25、8.25和8.30。含水量的优化:当含水量高于65%时,海带渣的固体明显的减小;96孔板对活性进行检测时,发现:50%与55%的含水量时海带渣的固体发酵产物的活性低,多数检测孔产红;60%、65%和70%的含水量时海带渣固体发酵产物的活性较高,检测孔基本不产红。发酵9d后各自的pH值分别为8.04、8.07、8.15、8.08和7.82。发酵温度的优化:96孔板微培养对不同温度条件下发酵9d后的海带渣的活性进行检测,实验结果表明:35℃下发酵的海带渣的活性高于其他温度条件下发酵的海带渣产物活性。接种量的优化:实验采用Tip-culture法(400μL2GY+400μL海带渣发酵水提取液+5μL寄生曲霉孢子悬液)对不同接种量条件下发酵9d后的海带渣的活性进行定量检测。实验结果表明,2%接种量的抑制寄生曲霉生长率为69.3%,4%接种量的抑制寄生曲霉生长率为83.5%,6%接种量的抑制寄生曲霉生长率为40.2%,8%接种量的抑制寄生曲霉生长率为59.5%,10%接种量的抑制寄生曲霉生长率为73.4%,12%接种量的抑制寄生曲霉生长率为62.7%。除CK组中的Tip管外,其他的Tip管均不产红。实验表明,4%的接种量为最优的接种量。pH值的优化:海带渣中含有大量的碱性金属离子,分别用pH值为1.0、2.0、6.5、7.0、7.5和8.0的去离子水配制海带渣发酵固体培养基,培养基灭菌后的pH值都在7.5~7.7之间,所以确定海带渣固体发酵的初始pH值为自然(7.6左右)。从上面的单因素优化实验的结果看蔗糖是海带渣固体发酵产物活性大小的决定因素,只有在外加蔗糖时,海带渣固体发酵才能更有效地产生抑制寄生曲霉的活性物质,也只有在外加蔗糖时,海带渣固体发酵才能有效地产生类植物激素细胞分裂素6-KT。鉴于K肥在农业生产中的重要意义,实验以KNO3的形式将K+离子与NO3-离子引入到海带渣固体培养基中,并进一步研究了以蔗糖和KNO3为外加碳源和氮源在不同水平上对海带渣固体发酵产物抑制寄生曲霉活性的影响。通过爬坡实验和响应面分析法进一步的对海带渣固体发酵的条件进行优化。爬坡实验:爬坡实验设计如表1所示,发酵5、10、15和55d后分别取样,采用Tip-culture的培养法(400μL2GY+200μL无菌水+200μL海带渣发酵水提取液+5μL寄生曲霉孢子悬液)对抑制寄生曲霉的活性进行定量的测定,测定的结果如表2所示。从实验的结果可知,第3组的活性最强,所有组合中活性最强的培养时间为5d或者10d,因此,以第3组和发酵8d作为响应面实验的中心点,即:蔗糖2.00%,KNO30.50%,培养时间8d。RSM优化培养基组成:根据单因素实验和爬坡实验的结果对实验进行响应面设计,实验采用BoxBenhnken实验设计海带渣固体发酵的条件,实验采用3因素3水平的响应面分析。Box-Benhnken设计每个因素取3个水平,以(-1,0,+1)编码,对数据进行二次回归,拟合,得到包括一次项、平方项和交互项的二次方程,分析各因素的主效应和交互效应,最后在一定水平范围内求取最佳值。本实验以对寄生曲霉的生长的抑制率为响应变量,并以蔗糖(%)、KNO3(%)及培养时间(d)为影响因子进行Box-Behnken响应面分析。实验方案及结果如表3所示,回归分析结果如表4所示。多项式模型方程拟合的性质由确定系数R2表达,其统计学上的显著性由T检验确定。方程模型的相关系数R2=0.8873,表明方程模型于实验数据有88.73%的符合度,调整后的R2Adj=0.7425,表明方程模型有较高的可信度。每个响应面分别代表着2个独立变量之间的相互作用,此时第3个变量保持在编码的0水平。由响应面图(图3)可以看出,蔗糖浓度、KNO3浓度和培养时间与对寄生曲霉生长的抑制率存在相关性,培养基中的随着蔗糖浓度、KNO3浓度与培养时间的增加,抑制率先增加后降低。在获得非线性回归模型和响应面之后,为了求得培养基最佳浓度,对所得的回归拟和方程分别对各自的变量求一阶偏导数,并令其为0得到三元一次方程组,求解此方程组可以得到最大抑制寄生曲霉生长率的最佳条件,即X1=20.91g(2.091%),X2=5.07g(0.507%),X3=8.24d,Y=72.23%。所以具有最大抑制寄生曲霉生产率的培养基组成与培养条件为:蔗糖为2.091%,KNO3为0.507%,含水量为60%,接种量为4%,培养温度为35℃,pH为自然,培养时间为8.24d回归模型验证实验:根据最优培养基配方对模型进行验证,寄生曲霉生长的抑制率为73.30%,实际值与预测值的误差为+1.07%。该结果表明,响应面法优化产海带渣固体发酵最佳培养基是