固氮菌剂的制备

固氮菌剂的制备

随着我国绿色植物和食品的发展，对绿色肥料的生产有了高需求。减少化肥的使用，发展农业可持续发展，改善土壤和环境。1固氮菌粉末的制造液体呼吸1.1调整溶液ph蒸馏水10L,白糖200g,磷酸二氢钾5g,硫酸镁2g,氯化钠1g,碳酸钙30g,调整溶液pH=7。把菌种及消过毒的培养液移入无菌室中,接种,于28℃保持1～2d,经常摇动促进繁殖,为第一代菌种,亦可进行第二代,第三代菌种培养,以备接种用。1.2接种及打气培养法液体培养液制备之后,装入培养筒内,经10.3kPa压力,高温杀菌30min,移到无菌室进行接种(倒入菌液20mL),加盖,把培养筒放在保温室内,28℃保温,用打气机进行打气培养,经36～48h,检查每毫升菌液中有固氮菌4～8亿,就可取出搅拌泥炭做成固氮菌剂。1.3营养液的制备泥炭晒干(河泥25kg,堆肥17.5kg,草木灰7.5kg比例)→初步切碎→烘干消毒→粉碎过筛→配料搅拌。(营养液配料:水10kg,砂糖1.6kg,硼酸8.4kg,钼酸铵8.4g,过磷酸钙4.5kg)。泥炭950kg,碳酸钙粉50kg,菌液20L,营养液213kg。2细菌检验2.1染色液的制备结晶紫原液:结晶紫7g,95%酒精100mL,把结晶紫原液20mL与1%草酸铵80mL混合,成为结晶紫染色液。路哥尔氏液:结晶碘1g,碘化钾2g,水300mL。沙黄原液:每1mL沙黄原液配10mL水。2.2固氮菌的形态取出干净的载片,先用1%无菌澄清氯化钠液滴一滴在载片上的中央处,再用白金丝从培养基上刮取一点放在1%氯化钠中稀释,放在600倍显微镜中观察其菌种形状和大小特征。固氮菌菌形是不一致的,变化很明显。在显微镜下观察,常见是单球,双球、三球、四球或几个球菌连在一起形成链球形;有明显的荚膜,球菌中有萤光。体积约为0.5×1μm。固体培养基中,大部分是由两个球菌连在一起形成“8”字型;在液体培养时,大部分是单球形及几个球菌连在一起形成链球形。2.3细菌的生理评价(1)细菌活动能力的测定把细菌接种在培养基上培养24h,菌落产生,用600倍显微镜观察细菌在液体中的活动能力,游动的快慢,细菌的纯度、变化等,同时进行记载,编列菌号。(2)固氮菌的检测糖类发酵培养基:糊精10g,磷酸氢二钾0.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.1g,碳酸钙3.3g,酵母粉0.1g,水1L,洋菜15～18g。上列培养基经10.3kPa压力30min消毒后,进行接种,培养2～3d后用溴甲香草酚兰测定,若是中性反应呈浅兰色,碱性反应兰色,酸性反应黄色或红色。固氮菌呈中性至微碱性反应。石蕊脱脂牛乳取脱脂牛乳粉100g,溶解在1L水中,加1mL25%石蕊,分装于若干试管中,放在高压杀菌器用10.3kPa压力30min,迅速放冷,再放入冰箱中,经过一星期变成紫红色,若为红色为失败,须重做。从冰箱拿出后,于恒温箱以28℃保温24h后接种,固氮菌有些品种接种后,在10～14d内变成澄清透明。固氮菌能力的测定培养基:葡萄糖20g,磷酸氢二钾0.2g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.2g,碳酸钙5g,洋菜15～18g,清水1L。取出上面培养基100mL,放在250mL三角瓶中,经高压杀菌后,以5～10mL菌液接种,放入28℃的保温箱培养5～6d,待菌落发育全面就可进行测氮分析。可按GB/5009.5-85,食品中蛋白质的测定方法进行测定氮含量。消耗糖能力的测定可按GB5009.7-85食品中还原糖的测定进行。(3)种间生长筛选把培养基放入试管中,经高压杀菌后,用白金丝接种,然后定温培养3～4d,好气细菌在表面发育生长,嫌气细菌在培养基中间生长,若中间有空泡或把培养基断裂为二段,均为嫌气细菌活动现象。(4)耐酸碱能力测定测定细菌耐酸与耐碱的能力可在培养基中加入不同浓度的酸或碱,并测定pH值,然后接种培养,经数天观察,即可知其耐酸碱能力。固氮菌最适宜的pH值为6.8～7.5。(5)计算的细菌数用菌数计数器计算菌落总数要大于6亿。2.4固氮菌的染色(1)要鉴别固氮菌,用7%碘溶液进行活菌染色(不要固定),经染色固氮菌呈深黄色,此外还可以用墨汁染固氮菌,因有明显的荚膜,可以与其他细菌进行区别。(2)经革