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文档简介
食品中4种肉类的多重pcr鉴别方法的建立与优化
0复合pcr检测其他种类猪肉中的物种[研究意义]肉与鲜肉混合是中国食品质量控制面临的主要挑战之一。不法企业在利益的驱使下使用相对廉价的猪肉、鸡肉等肉类原料,冒充牛肉、羊肉制品进行销售,严重侵犯了消费者的合法权益。然而,传统的依靠感官与经验的肉类形态学鉴别手段已远不能满足对肉制品掺假现象进行控制与监管的需要。因此,对于中国肉制品市场占有率较高的猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉,建立科学、准确、快速、高通量的筛选方法已十分必要。【前人研究进展】以聚合酶链反应(PCR)为基础的技术已逐步成为了肉类种属鉴定的核心方法。许多学者根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物,利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增,继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。近年来,实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度,并使得肉类含量的定量溯源成为可能。在目标基因选择方面,动物线粒体基因组DNA序列具有高度的物种特异性,且由于拷贝数多而在食品加工过程未完全降解,因此其多态性位点是设计肉类成分定性检测的首选靶点。目前,根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物,所建立的PCR与实时荧光PCR方法已有大量报道,且进入了中国权威的检测技术标准。Girish等基于线粒体12SrRNA基因,应用PCR-RFLP成功鉴定了牛肉、水牛肉、绵羊肉及山羊肉。Dooley等基于线粒体细胞色素b基因,分别建立了牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉和火鸡肉的实时荧光定量PCR检测方法。方法设计方面,在同一反应体系中加入多对引物的多重PCR技术应用于食品中动物源性成分的鉴别,可提高检测效率与检测通量。Ghovvati等基于线粒体12SrRNA和16SrRNA基因应用多重PCR技术对反刍动物、家禽和猪进行鉴。Soares等应用双重PCR在猪肉中成功检测到禽肉。Fajardo等采用多重PCR技术成功鉴定出了3种鹿的亚种。在中国,陈文炳等应用单重PCR和双重PCR能分别对食品中猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉等肉类成分进行鉴定。【本研究切入点】在实际检测中,尤其在需要对大量的食品样本进行肉类掺假的筛选时,提高检测效率与通量对于及时监管十分重要。以多重PCR为基础,建立多种肉类成分同时鉴别的快速检测技术是提高效率的有效途径之一。然而目前,针对中国肉类掺假现状,应用多重PCR的肉类快速鉴别与筛选技术尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究根据动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点,利用正向引物共用、反向引物特异的策略,建立用于猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉4种肉类DNA快速检测的UP-M-PCR体系。1材料和方法试验于2010年12月—2011年4月在南京农业大学肉品加工与质量控制教育部重点实验室进行。1.1试验材料生(熟)猪肉、生(熟)牛肉、生(熟)羊肉、生(熟)鸡肉、生马肉、生驴肉、鲫鱼、大豆粉等均购于南京市农贸市场。1.2细胞、动物组织和生化试剂PCR仪(Veritee96-well,美国ABI公司);核酸电泳仪(SUB-cellGT,美国Bio-Rad公司);凝胶成像系统(UniversalHoodⅡ,美国Bio-Rad公司);高速冷冻离心机(3-18K,美国Sigma公司)。血液、细胞和动物组织的基因组DNA提取试剂盒购自Qiagen公司;ExTaqDNA聚合酶及反应缓冲液、dNTP、MgCl2、DNA分子量MarkerDL1000、电泳上样缓冲液等PCR生化反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司;电泳级琼脂糖购自南京生兴生物公司;引物合成、DNA测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。1.3测试方法1.3.1dna的提取分别使用DNeasy组织细胞DNA提取试剂盒、SDS-蛋白酶K法及CTAB-蛋白酶K法提取生鲜的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中的总DNA。其中,DNeasyDNA提取试剂盒法按说明书操作;SDS-蛋白酶K法参照《分子克隆》第三版;CTAB-蛋白酶K法则参照Dooley等的方法。SDS-蛋白酶K法与CTAB法均使用氛/氯仿抽提进行核酸纯化。50mg样品的总DNA均溶解于100μLTE缓冲液中,于OD260/280测定吸光度值,计算DNA浓度和纯度。1.3.2pcr引物设计引物的设计与特异性位点的选择依照Matsunaga等的方法并作适当修改。根据猪(GenBank登录号:GU135833.1)、牛(GenBank登录号:HQ184045.1)、山羊(GenBank登录号:AB044308.1)、绵羊(GenBank登录号:HM236185.1)、鸡(GenBank登录号:GU261717.1)线粒体细胞色素b基因序列,采用正向引物共用、反向引物特异的策略,设计两套各5条多重PCR引物,第一套引物长27—28bp,第二套引物长18—20bp,两套引物使用相同的种属特异性位点,即第二套引物由第一套引物截短而得到。两套引物在线粒体基因组中的结合位置见图1,引物序列、Tm值与扩增片段大小见表1。1.3.4检测特异性验证按照1.3.3的反应体系及优化的反应条件,分别使用4种目标肉类DNA及其两两等比例混合物、鱼肉、马肉、驴肉和大豆来源的DNA对两套引物的检测特异性进行验证与比较。1.3.5多重pcr方法的灵敏度将100ng·µL-1的4种目标肉类DNA10倍梯度稀释,使用1.3.3的反应体系及优化的反应条件,分别针对猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉4种肉类考察多重PCR方法的灵敏度。1.3.6t载体组合分离主导型高效聚合酶链反应物的合成使用优化的多重PCR方法对猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉4种目标肉类DNA进行扩增,产物电泳后割胶回收纯化,参照《分子克隆》第三版对纯化产物进行T载体连接、转化、克隆筛选及鉴定,并委托测序。测序结果与GenBank上的已知序列进行比对。1.3.7用于市场领导的实际检验使用优化的多重PCR方法对市售的80份各类肉制品进行的鉴定,验证方法的实用价值,并了解市场上肉类掺假的真实状况。2结果2.1不同方法对鲜食中dna提取效果的影响分别使用DNeasy试剂盒、经典的SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法提取猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉4种肉类的总DNA。表2列出了应用3种方法对生鲜肉提取的结果。SDS-蛋白酶K法与DNeasy试剂盒法所提取的DNA浓度处于同一个数量级,SDS-蛋白酶K法在浓度与纯度方面均略优。CTAB-蛋白酶K法由于对肌肉组织消化效果较差,因此DNA提取效率显著偏低。相比于SDS-蛋白酶K法,DNeasy试剂盒大大节省了提取时间,且无需使用苯酚、氯仿等有毒试剂,综合考虑提取效率及试验安全性,后续试验中均采用DNeasy试剂盒提取食品中的总DNA。2.2确定猪肉和猪肉的最佳配比通过梯度PCR试验,综合反应特异性与产物量,确定使用两套引物的最佳退火温度均为52℃。分别使用4种目标肉类DNA及其两两混合物、鱼肉、马肉、驴肉、大豆来源的DNA为模板,对两套引物进行特异性验证及比较(图2)。由图2可见,使用两套引物针对4种目标肉类DNA进行检测,均在设计位置能观察到特异性条带,未见明显非特异性扩增,且与鱼肉、马肉、驴肉和大豆DNA均无交叉反应。然而,第二套引物在检测目标肉类两两混合的DNA时,当牛肉DNA与羊肉或猪肉DNA中的一种混合,牛肉成分均未被检出。这可能是由于第二套引物过短,与不同模板正确配对的碱基比例相差较大,在多重PCR体系中优先与羊肉或猪肉DNA结合,从而影响了检测的特异性与稳定性。对南京农业大学食品科技学院肉品加工与质量控制教育部重点实验室制取的4种肉类的熟制品进行检测,特异性试验结果相同。同时,检测人为制成的生鲜肉两两混合物提取的DNA,与DNA两两混合物PCR的结果相同。因此,在后续试验中,将仅使用第一套引物进行引物灵敏度试验和样本的实际鉴定。2.3pcr法测灵敏度将100ng·µL-1猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉来源的DNA模板原液进行10倍梯度稀释,使用第一套引物对之进行检测以考察方法的灵敏度(图3)。由图3可见,目标DNA稀释103倍后,使用多重PCR法进行检测,均仍可观察到微弱的特异性扩增。因此,检测的灵敏度可达皮克级。对于4种目标肉类DNA两两混合物模板的检测及熟制品检测,灵敏度试验结果相同。2.4同源性的确定将2.2中4种目标肉类的特异性条带回收纯化,纯化产物连接入T载体并委托测序,将测序结果与GenBank中的已知序列进行比对。比对结果显示,猪的测序结果与已发表序列(GenBank登录号分别为GU135833.1、GU135832.1、GU135798.1)、牛的测序结果与已发表序列(GenBank登录号分别为HQ184045.1、HQ184038.1、HQ184037.1)、山羊的测序结果与已发表序列(GenBank登录号分别为AB044308.1、AB004073.1、AB004069.1)、绵羊的测序结果与已发表序列(GenBank登录号分别为HM236185.1、HM236184.1、HM236177.1)、鸡的测序结果与已发表序列(GenBank登录号分别为GU261717.1、GU261715.1、GU261714.1)的同源性均在99%以上,与预期基本一致,确定分别为猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉成分。2.5样本的分类和检测结果使用上述多重PCR方法对市售的80份食品样本进行了4种肉类的鉴定。样本的分类与检测结果见表3。由表3可知,肉类掺假普遍存在于调理生肉制品、酱卤肉、干制品和火腿制品等各类食品中,掺假率达16.3%。3pcr检测其他种类猪肉的最佳条件在动物源性成分鉴定中,多重PCR技术是较为常用的鉴定方法之一。本试验在参考前人研究的基础上,基于物种间线粒体细胞色素b基因的序列差异,建立了4种常见肉类成分快速检测的通用引物多重PCR方法。多重PCR是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。以多重PCR为基础的肉类成分鉴别技术具有检测通量高、仪器设备简单、操作方便且检测费用节省的优点,但由于其需要在同一PCR体系里加入多对特异性引物,复杂的PCR体系易造成方法灵敏度降低以及对不同目标序列扩增效率不一致,从而使得相关方法的推广与标准化受到限制。本研究采用了正向引物通用、反向引物特异的UP-M-PCR设计策略,即应用包含5条引物的多重PCR体系实现4个物种的鉴别,最大限度地避免引物数量过多造成的交叉干扰。目前,通用引物多重PCR方法对食品中大肠杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌及水中脊髓灰质炎病毒、柯萨奇B组病毒和埃可病毒等肠道病毒的检测已有报道,用于肉类品种鉴定在中国尚属首次。相比于Soares等鉴别动物源性成分的单重与双重PCR技术,本研究应用5条引物同时实现对4种肉类成分的鉴别,大大提高了检测效率和检测通量。与Ghovvati等应用多重PCR对反刍动物、家禽和猪进行鉴定相比,本研究主要针对中国肉类掺假现状进行试验研究,具有较显著的现实意义和应用价值;相比于中国出入境检验检疫标准SNT/2051-2008中应用实时PCR对食品、化妆品和饲料中牛、羊、猪源性成分进行鉴别,本研究具有检测仪器简单、检测成本节省、检测通量较高等优点,更适合于对大量肉制品掺假的鉴别筛选。影响多重PCR反应效果的因素很多,其中引物设计直接影响PCR扩增的特异性与灵敏度;另外,PCR体系的优化可以使多重PCR得到最佳效果。一般认为,在一定范围内,引物序列越长,PCR反应的特异性越高、灵敏度越低。因此,在方法设计中,选择合适长度的多重PCR引物序列,从而获得最优化的检测灵敏度、特异性及各目标片段扩增均一性将尤为关键。对此,本研究基于相同的特异性位点设计了长度不同的两套引物,试验结果显示,使用长度为27—28bp的第一套引物时,在优化的反应条件下,对4种目标肉类DNA及其两两混合物的检测表现出良好的特异性与灵敏度,灵敏度达到皮克级。当把引物片段长度降低到18—20bp时,对目标肉类混合物的检测表现出扩增效率的差异,牛肉成分难以被检出。在本研究所使用的肉中总DNA提取方法中,Qiagen公司的DNeasyDNA提取试剂盒是当前组织细胞DNA提取最受肯定的商品化技术之一,而SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法均是组织中总DNA提取的经典方法。CTAB-蛋白酶K法由于CTAB难以完全裂解肌肉组织而导致DNA提取效率显著偏低;DNeasy试剂盒法与SDS-蛋白酶K法均采用含SDS的缓冲液裂,均可有效地裂解肌肉细胞,但DNeasy试剂盒法中纯化柱对核酸的回收率低于酚/氯仿抽提,考虑到提取效率与安全性,本研究优先采用DNeasy试剂盒提取肉制品中的总DNA。考虑到肉制品掺假的实际往往是使用一种廉价肉类代替或掺入另一种价格相对较高的肉类,因此在同一多重PCR反应体系中针对多种肉类同时鉴定方面,本研究重点考察了目标肉类两两混合时的检测特异性。进一步的试验表明,本文建立的多重PCR技术对于同时鉴定目标肉类中的3或4种也具备良好的效果。同时,鉴于山羊肉与绵羊肉的价格区别不大,市场上此类掺假较少,本研究使用了山羊与绵羊的通用引物作为羊肉鉴定的特异性引物。4定量pcr检测成本建立了灵敏、可靠的4种肉类成分快速鉴定的多重PCR方法,相比于现有标准中的单重PCR技术提高了筛选通
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