硫酸软骨素蛋白多糖的神经机制

硫酸软骨素蛋白多糖的神经机制

近年来，中枢神经系统（cns）的研究呈现出一个新热点。详细分解和细胞外基质的组成、分子活性、生理功能、病理改变等方面的研究引起了人们的关注，并取得了巨大成功。研究发现,CNS无论是在胚胎期还是成年期,都含有丰富的细胞外基质成分,它们在神经系统的发育、功能、可塑性的改变等方面都发挥着极其重要的作用。硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitinsulfateproteoglycans,CSPGs)正是CNS细胞外基质中一种重要的组成成分。无论是发育期、成熟后还是病理状态下,CSPGs的表达都受到精确的调控,并通过和其他粘附分子及生长因子的结合,在不同的时间和空间发挥不同的生理功能。在发育过程中,CSPGs可以影响神经细胞的迁移和轴突生长;成年后CSPGs参与神经可塑性的调控;而在CNS受损后,作为胶质瘢痕的重要组分,CSPGs参与抑制受损神经的再生。本文将详细介绍近年来有关CSPGs的一些研究进展,并重点探讨其在CNS的发育和病理情况下所发挥的不同功能和相应的作用机制,以及对治疗CNS损伤的启迪。一、蛋白质多糖的功能蛋白多糖由核心蛋白和共价连接的一个或多个线性糖氨多糖链(glycosaminoglycan,GAG)组成,根据GAG的结构组成不同,可以分为硫酸肝素蛋白多糖、硫酸软骨素蛋白多糖、硫酸皮肤素蛋白多糖和硫酸角质素蛋白多糖等不同类别。它们或存在于细胞外基质中,或定位于细胞表面,亦或存在于胞内颗粒中,参与炎症、伤口感染及愈合、止血以及生长因子的信号途径等一系列重要的生理活动。近年来,研究人员发现脑内蛋白多糖的时空表达在CNS发育和成熟过程中受到精确调控,而且越来越多的证据表明它们作为重要的调节分子参与神经细胞的迁移、轴突导向、突触形成以及结构可塑性的改变等与神经系统的发育和功能密切相关的生理活动。(一)ticar家族的酶学性质研究CSPGs是哺乳动物CNS中含量最丰富的一种蛋白多糖,由核心蛋白和含有硫酸软骨素(chondroitinsulfate,CS)二糖重复单位的GAG所组成。根据核心蛋白的不同,CSPGs可分为:lectican家族(包括aggrecan、versican、neurocan、brevican)、neuroglycanC、NG2、受体型蛋白酪氨酸磷酸酶RPTPβ以及它的剪接变异体phosphacan、decorin、biglycan和appican。此外,其GAG组分也包含6种不同的CS二糖单位,其差异主要取决于不同的软骨素磺基转移酶(CSSTs)的存在和活性高低。该酶存在于高尔基复合体中,主要负责GAG的硫酸化,不同的酶形成诸如CS-A、CS-C、CS-D、CS-E等不同的结构基序,而且不同的硫酸化模式还会改变GAG的结合特性,进而影响CSPGs的整体功能(Kinoshita等.2001)。(二)bergann胶片研究发现不同的CSPGs有不同的表达格局:如neurocan主要存在于成年CNS中,由星形胶质细胞及少突前体细胞产生;NG2分布于成年大脑的少突前体细胞上,也有些定位于血管和脑膜细胞上,该分子剪切后,还可以分泌到细胞外基质中;Phosphacan以及它的膜相关形式RPTPβ在出生后大鼠小脑的Bergmann胶质中表达水平非常高,在大脑和脊髓的其他部位也有分布;brevican在整个CNS都有分布,由星形胶质细胞合成;其中versican、brevican和aggrecan在成年大脑中的表达量明显高于其在发育中大脑的表达量。(三)cspgs的紧急相关作用体内的CSPGs有不同类型的结合配体,包括生长因子、细胞粘附分子、基质成分、酶以及酶的抑制剂,它们在CNS发生过程中通常显示共定位,除了作为结构分子支持细胞外,还参与了大脑发育中的许多关键事件和步骤(图1)。研究发现绝大部分CSPGs和细胞表面受体或基质成分之间的相互作用都是通过GAG上的结合位点介导的。因此下文介绍CSPGs在神经系统发育和受损后的作用时,主要关注它们的GAG。事实上,CSPGs的功能研究大部分是通过采用硫酸软骨素酶降解GAG来验证的,当然,还有应用GAG合成抑制剂,如氯酸钠或木糖苷,或者采用基因敲除方法破坏GAG的合成酶,最终造成CSPGs中的GAG含量降低,然后观察其功能变化。二、cspgs的生长导向功能在神经元的发育过程中,CSPGs主要通过形成屏障结构发挥其生理功能。已被证实的最早的CSPGs屏障功能出现在新杆状线虫的早期囊胚期,此时抑制GAG的合成或用酶降解GAG后,可导致细胞质分裂的逆转,同时还导致新分裂细胞重新融合形成多核体。此外它可能还参与细胞的增殖,因为某些CSPGs,特别是phosphacan,它们的表达可出现在胚胎大脑一些活跃的细胞增生区,比如神经节突起的室区以及脊髓中央管的室管膜层,但是它们在这些部位的功能还不清楚。研究还发现,CSPGs对于神经发育过程中的细胞迁移也有重要作用。神经细胞的迁移主要依靠迁移途径上存在的吸引或排斥信号来指引方向的,其中抑制性信号就是由CSPGs的GAG提供的。比如神经嵴细胞的迁移路径中有许多关键节点,在这些位点,细胞的移动需要避开包含GAG的区域,即CSPGs在此处充当屏障结构来调整细胞的迁移方向。如果在该节点抑制GAG的合成,神经嵴细胞的迁移就会失去控制而形成某些异常轨迹。相反,如果把含有CSPGs,如aggrecan的微膜放置在神经嵴细胞的迁移路径上,同样也会造成细胞偏离正常的运动轨迹或直接停下来,这种效应也正是通过GAG来介导的(Perissinotto等.2000)。此外,CSPGs的GAG还可以对发育过程中轴突的延伸构成障碍,进而影响轴突的生长模式。比如CSPGs含量特别丰富的脊索区域,也是轴突延伸的一种屏障结构,用硫酸软骨素酶消化后,可引起胚胎运动神经和背根神经节轴突的异常生长。CSPGs的轴突导向作用还可见于脑部,研究发现当把三叉神经节神经元培养在胚胎小鼠的脑部切片上时,它们会按照合适的路线生长,一旦用酶预先破坏其GAG,轴突生长就会偏离正常轨迹,而投射到一些原本不支持轴突生长的间质区域。研究进一步发现,视觉系统也有类似现象,而且已被公认为研究CSPGs生长抑制功能的良好模型。体外培养的视网膜轴突的延伸始终要避开CSPGs富集区,而只在诸如laminin之类的生长许可性底物上才能生长。体内视神经通路上的某些节点同样存在CSPGs的导向作用,譬如视网膜的外层含有高水平的CSPGs,当视网膜成熟后它能指引视细胞的轴突向内侧的视神经方向生长,而避免其向视网膜外生长;一旦用酶降解其GAG后,轴突的生长就会变得随机而无规律。此外,视交叉和视神经束的生长方向也依赖局部CSPGs的浓度,酶消化可以破坏神经节轴突穿越中线和朝向顶盖生长时的准确方向(Ichijo等.2001)。以上诸多现象都表明CSPGs在CNS发育过程中具有广泛的导向功能,而且其功能的发挥主要是通过GAG来介导的。研究证实哺乳动物CNS的发育存在一个特定的“时间窗”,在此之前可塑性相对较强,仍有可能建立新的突触连接,此期之后可塑性迅速降低,而CSPGs参与构成的神经元周围网络(perineuronalnets,PNN)在此发挥重要作用,如视皮质中PNN在发育中出现的时间恰好与其可塑性骤降的时期相吻合。另一方面,正常发育的成年大鼠视皮质中的GAG一旦用酶降解,其可塑性即回复至发育早期的水平,这些都表明神经元周围的CSPGs是限制新突触连接形成和重新分布的非许可基质,是可塑性受限制的重要原因;人为改变CNS中CSPGs的表达可以影响轴突的生长特性和可塑性,这对于某些CNS的损伤和疾病的治疗有着重要指导意义和临床应用价值。此外,CSPGs家族的不同成员在CNS发育过程中独特的时空表达模式,多样的生理功能以及所引起的细胞外基质理化性质的改变也会影响神经系统的可塑性。三、cspgs的抑制作用CNS损伤通常会造成胶质细胞增生,包括反应性星形胶质细胞、小胶质细胞以及少突前体细胞的扩增和迁移,最终可引起胶质瘢痕的形成。研究发现在这个过程中,损伤周围的CSPGs的表达模式会发生不同性质和程度的改变,比如文献报道neurocan和NG2在大脑和脊髓损伤后表达都有上调(Tang等.2003),但并不是所有的CSPGs分子在胶质瘢痕中的表达都是上调的,其变化模式相当复杂。比如有人利用免疫组化和原位杂交证明在大脑损伤后phosphacan表达上调,但用蛋白印迹法却发现其蛋白水平在损伤后反而下降,而在7～14天后的较晚阶段才上升(Morgenstern等.2002)。还有报道versicanV2在大鼠脊髓损伤后的瘢痕组织中呈下降趋势(Tang等.2003),而在皮层损伤后却是上升的(Asher等.2002)。因此推测CNS损伤后,CSPGs表达模式的变化可能取决于损伤的类型、部位及损伤动物的年龄等等。而这种表达的改变可能来源于组织损伤和血脑屏障的破坏所引起的局部炎症细胞入侵和炎症因子的释放。CNS损伤后,胶质瘢痕以及其中的CSPGs主要起屏障作用,隔离受损部分,限制空洞产生和二次损伤,即所谓保护性作用。但胶质瘢痕和CSPGs也是CNS受损后神经元轴突再生的主要抑制分子,其中某些CSPGs在CNS损伤后的几个月一直维持增高的水平。Davies等(1999)发现移植的背根神经节(DRG)神经元的轴突生长可以通过完整的或退化的CNS髓鞘,但它一旦接触到损伤区富含CSPGs的胶质瘢痕时,轴突就会停止生长,这直接证明胶质瘢痕组织充当了轴突再生的抑制因素。此外还有一些结果也证实胶质瘢痕中CSPGs确实对轴突生长有抑制作用,比如反应性星形胶质细胞在体外能够上调CSPGs的表达,从而对体外生长的DRG的轴突延伸发挥GAG依赖的抑制效应;此外,在成年大鼠的皮层中移植硝酸纤维素膜,造成局部的胶质瘢痕组织后,用硫酸软骨素酶处理该组织,结果瘢痕表面的神经元轴突生长显著增加。与之相似,用该酶处理受损脊髓组织切片后,DRG在该组织片上的轴突延伸也明显增强;另一方面,如果用抗体封闭laminin,就发现这种由酶处理引起的、培养在胶质瘢痕或者脊髓组织上的神经元生长增强效应明显降低,这说明CSPGs抑制轴突生长的作用,可能是通过干扰有生长促进效应的基质分子laminin和它的受体之间的作用来实现的(Zuo等.1998)。体内研究已证明,用酶消化法将GAG从CSPGs的核心蛋白上去除,是克服CSPGs介导的轴突生长抑制作用的一项成功的治疗策略。比如黑质纹状体损伤后将硫酸软骨素酶注入损伤位点能促进多巴胺能神经元的再生;用该酶治疗动物的脊髓损伤,除了能够促进感觉和运动神经元的再生外,还伴随有部分运动及本体感觉功能的恢复。最近,研究发现酶消化后产生的CSPGs降解产物,还可能通过减少T淋巴细胞的浸润、小胶质细胞的激活及炎症因子的释放,参与调节损伤局部的炎症反应,尽量减少神经元的损伤,促进功能的恢复。此外,Grimpe和Silver将一种DNA酶注入脊髓损伤组织局部,选择性降解GAG合成途径中木糖转移酶1的mRNA,使CSPGs核心蛋白上糖氨多糖合成的起始反应受阻,同样也能够起到相似效应,使移植的DRG神经元的轴突在脊髓损伤处的边缘得以生长,由此可见CSPGs是CNS损伤后轴突生长的一种相当重要的抑制因子。但也有人在CSPGs的研究中发现有些GAG在某些动物发育模型中反而能促进轴突的生长,如CS-E型的GAG对于小鼠胚胎轴突就有促进生长作用(Kinoshita等.2001)。研究还发现,在鸡胚和小鼠的大脑发育过程中,几种不同的CS亚型的构成比对于它们所发挥的神经生长调节功能有着至关重要的作用,其表达模式受到精确调控;而负责合成不同GAG的酶——CSSTs在此过程中的表达同样具备精确调控。同样,CNS损伤后,CSSTs的转录水平也会发生改变,而且已证明它参与了胶质瘢痕中CS-C、CS-D表达的上调以及CSPGs介导的轴突生长抑制作用。研究还发现该酶在Neu7细胞、脑损伤源性的细胞因子刺激后的星形胶质细胞和少突前体细胞中的表达水平都比较高,因此推测它们可能也与此类细胞在损伤后所发挥的轴突再生抑制有关。以上种种提示在发育及损伤过程中,GAG合成酶CSSTs的表达在目前未知的调控作用下产生特定的表达模式,从而决定了其所合成的GAG的结构组成,进而调控了CSPGs所发挥的生理功能及病理状态下的抑制作用。四、cspgs的功能CSPGs抑制轴突生长和可塑性的作用机制至今并未完全阐明,可以推测,细胞外分泌的CSPGs必须通过细胞表面受体分子的介导才能发挥作用,但目前它们的特异性受体尚未得到鉴定。不过研究也发现某些CSPGs可以与细胞粘附分子结合(图1),如神经细胞粘着分子NCAM和神经胶质细胞粘连分子NgCAM,因而推测此类分子可能转导了细胞外CSPGs的作用信号。正如前文所述,CSPGs的许多作用都是依靠其GAG发挥的,但也有一些功能与该结构无关,还有些效应需要核心蛋白和GAG共同参与。目前推测CSPGs的作用机制可能包括以下几种:直接和神经元胞膜上的受体结合;和生长促进分子结合,遮蔽其活性位点;和生长促进分子的受体结合,发挥竞争性抑制;直接表达在神经元胞膜上,通过自身的胞内段启动信号级联反应等等。有报道CSPGs的GAG可以和肝素结合因子以及某些成纤维生长因子(FGF)家族成员结合,将后者递呈给相应的受体或者将后者与其受体分隔,由此发挥不同的效应,也有可能CSPGs结合或递呈的分子是目前未知的某些活性分子。最近,有人证明CSPGs的GAG可以结合到信号素semaphorin5A的血小板反应素区域,将其从许可性分子转变为抑制性分子。而Zacharias等则发现大脑细胞外基质中的CSPGs中还可以和基质分子粘蛋白tenascin-R构成复杂的相互作用的网络,在神经系统发育过程中精确调控突起的生长和形态。值得注意的是,GAG的功能发挥还有赖其自身硫酸化的模式,硫酸化模式不同,由GAG引起的抑制活动也有差异;在体外,如果抑制胶质瘢痕中GAG的硫酸化,也可以减弱大部分轴突生长抑制活性。目前研究人员对CSPGs发挥功能所涉及的细胞内信号转导途径还不是很清楚,最近有报道Rho/ROCK通路可能参与了CSPGs的信号转导,如aggrecan能激活DRG神经元中小GTP酶家族中Rho的活性;一旦应用Rho的抑制剂C3转移酶,就可以阻断CSPGs所介导的视网膜神经节细胞的轴突生长抑制效应;同样,如果用Rho激酶ROCK的抑制剂Y-27632抑制ROCK的活性