梓醇对原代培养的新生sd大鼠大脑皮质神经元生存活性及轴突生长的影响

梓醇对原代培养的新生sd大鼠大脑皮质神经元生存活性及轴突生长的影响

梓醇是黄连最重要的有效成分之一。它具有利尿、缓解腹泻、降血糖、肝脏保护等多种药理作用。近年发现,梓醇对短暂性脑缺血所致脑损伤具有明显的神经保护作用,能保护神经元免遭细胞毒性损害,对脑外伤、脑代谢障碍、缺血性脑卒中和帕金森病等多种脑部病变可能具有潜在的治疗价值。梓醇是否具有“填精补髓”的作用,能否像地黄饮子一样有效治疗脑卒中后遗症等问题目前尚未见报道。脑卒中后神经功能恢复主要依赖于健存神经元轴突芽形成新的连接和神经新生,有效促进神经元轴突生长和神经新生的药物和手段可能对卒中后神经功能恢复有益。因此,本研究观察梓醇对培养的大鼠大脑皮质神经元生存活性及轴突生长的影响,旨在为阐释滋阴类中药或方剂如地黄和地黄饮子等治疗脑卒中的作用机制提供实验依据,并为研发新的有效治疗脑卒中的天然药物奠定基础。1药物、试剂与仪器1.1取材动物出生后24h内的SD大鼠乳鼠,购自重庆医科大学实验动物中心,动物合格证号:检动字2002A040。1.2主要试剂与药物NeurobasalA,DF12培养基,B27添加剂购自Gibco公司(美国);胰蛋白酶、二甲亚砜(DMSO)、四氮唑蓝(MTT)均为美国Sigma公司产品;胎牛血清(FBS)为Hyclone公司产品;鼠抗人神经丝蛋白200×103(NF-200)单克隆抗体(BM0100),SABC试剂盒(SA2001),DAB显色试剂盒(AR1022)均为武汉博士德生物技术有限公司产品。梓醇对照品购自中国药品生物制品检定所(批号110808-200508);胞磷胆碱注射液为山西晋新双鹤药业有限责任公司产品,批号200607281。1.3主要仪器二氧化碳培养箱(美国ThermoForma公司),96孔细胞培养板(美国NatureGene公司),倒置相差显微镜和测微尺(日本Olympus公司),550型全自动酶标仪(美国BioRad公司)。2样品采集及测定2.1皮质神经元培养无菌条件下取出生后24h内的乳鼠大脑皮质,剪去胼胝体和其他白质,D-Hank液清洗两遍,0.2%胰酶溶液37℃消化5min,制备细胞悬液,以1×105细胞密度接种于两块96孔板内,每孔接种100μL。在37℃,5%的CO2培养箱中培养,培养基为DF12,血清浓度为15%。培养24h后全量换成NeurobasalA神经元专用培养基(含2%B27),选择性培养神经元,以后每3d半量换液1次。2.2分组及药物干预皮质神经元培养第6天后进行神经元鉴定,并分组开始作相应药物干预,继续培养48h后行指标检测。实验分为空白组、梓醇干预组和胞磷胆碱组。空白组不用任何药物;梓醇干预组分设终浓度为0.25,0.5,1.0,2.5,5.0mg·mL-15个组,梓醇用NeurobasalA神经元专用培养液配制;胞磷胆碱组为本实验阳性药物对照组,其终浓度为1mg·mL-1。每组重复3次。2.3神经元鉴定及纯度检测皮质神经元培养6d后,弃培养液,用0.02mol·L-1PBS洗2min×3次,加入4%多聚甲醛室温固定15min后,用NF-200单克隆抗体免疫组化染色鉴定神经元。阴性对照用0.02mol·L-1PBS代替一抗,其余步骤同上。镜下观察,阳性细胞胞浆内有棕黄色颗粒沉着。在400倍镜下分别计数3个孔各5个视野的阳性细胞数和总细胞数,计算阳性细胞的百分比,以此代表神经元纯度。2.4MTT法检测神经元生存活性各实验组药物干预48h后,1000r·min-1离心2min,弃原培养液,每孔加入180μL无血清培养液及20μLMTT,继续培养4h。1000r·min-1离心2min,弃原液,每孔加入DMSO200μL,震荡5min,选择570nm波长,用酶标仪检测各孔吸光度(A)。2.5形态学观察及轴突长度测量神经元种植后定时在倒置相差显微镜下观察其生长情况。药物干预48h后,HE染色,400倍镜下测量神经元轴突起始部至生长锥末端的距离,计为神经元轴突长度。每组各孔随机选择5个视野,共测量100个神经元轴突长度,所测细胞必须有晕光和突起,取其平均值为该组结果。实验中测量目尺1个刻度表示25×10/98μm。2.6统计方法实验数据以x¯±sx¯±s表示,用SPSS13.0统计软件处理。首先采用单因素方差分析检验各组总体均值之间的差别有无显著性;若有显著性意义,再用t检验进行两个均值之间的比较。3结果3.1神经元培养液皮质神经元在接种后分散良好,接种后最初3h呈圆形透明,无突起;培养4~6h可见单个细胞圆形贴壁,胞体饱满,折光性好;培养24h,可见大部分细胞已贴壁生长,部分细胞伸出细小突起;培养2d后更换为神经元专用培养液,非神经元飘浮崩解死亡,神经元生长状态良好,胞体饱满,核大,折光性强,突起延长;第5~6d突起明显延长,折光性强,有立体感,周围有光晕,但绝大多数神经元仅可见有一根较长的轴突,尾部可见明显的呈纺锤形的生长锥;少部分神经元突起有分支,部分细胞突起交织成网;第6天鉴定并进行药物干预,干预后2d,终浓度为1.0,2.5,5.0mg·mL-1的梓醇干预组细胞晕光明显,轴突较空白组和胞磷胆碱组更长,更粗。3.2抗癫痫药物和纯度的测定NF-200免疫组化显示,神经元胞浆内可见棕色阳性颗粒,而阴性组未见相应的免疫反应;培养神经元纯度为95%以上。3.3各种药物干预促进了对神经元生物活性的影响MTT法检测结果显示,梓醇各浓度组神经元生存活性差异无显著性,梓醇各浓度组与空白组、胞磷胆碱组的差异无显著性,见表1。3.4不同浓度0.5mgml-13个芹江-7-1的轴突生长药物干预2d后,0.25mg·mL-1梓醇组轴突长度明显小于空白组和胞磷胆碱组(P<0.05);0.5mg·mL-1梓醇组轴突长度与胞磷胆碱组、空白组差异无显著性;1,2.5,5mg·mL-13个梓醇组的轴突长度均比胞磷胆碱组、空白组明显延长(P<O.05),提示梓醇浓度在1~5mg·mL-1时,可明显促进神经元轴突延伸。梓醇各组间比较,浓度为2.5mg·mL-1时对神经元轴突生长促进作用最强;浓度增至5mg·mL-1时,其促进作用较2.5mg·mL-1组减弱,见表1。4《黄秋葵》成岩药本研究结果未显示课程内容的调节作用地黄是滋阴、补血、填精、补髓的代表中药,既往研究表明,“补肾填髓”中药可促进神经元细胞能量代谢和利用,增加内源性神经营养因子生成,抑制神经毒素的生成,从而减少神经元死亡,促进神经元存活与再生。但地黄类药物对神经元生存活性和轴突生长有无影响尚缺乏直接的实验依据。本研究观察了地黄的主要活性成分-梓醇对离体培养的新生大鼠皮质神经元生存活性及轴突生长的影响。结果发现,梓醇终浓度在1~5mg·mL-1时可明显促进神经元轴突生长,2.5mg·mL-1时促进作用最强(P<0.05),提示适宜浓度的梓醇能促进大脑皮质神经元轴突生长。既往报道多种葡萄糖苷类物质,包括梓醇,对PC12细胞的轴突生长有分化促进作用,但国内外尚未见梓醇促进大脑皮质神经元轴突生长的报道。本研究结果证实,一定浓度范围的梓醇可明显促进大脑皮质神经元轴突生长,而脑卒中后神经元轴突再生障碍是其功能恢复不全或根本无法恢复的主要原因,为地黄及其组方地黄饮子有效治疗脑卒中后遗症提供了较直接的细胞学依据。本研究发现,梓醇终浓度增至5mg·mL-1时,其促神经元轴突生长的作用仍然存在,但较2.5mg·mL-1组已呈下降趋势,提示高浓度梓醇可能会表现出一定的细胞毒性作用。这与Li等动物实验结果相吻合,他们发现梓醇剂量为100和50mg·kg-1时,动物的死亡率为100%,剂量为20mg·kg-1时,动物的死亡率为25%。本研究还发现,梓醇终浓度为0.25mg·mL-1时不促进神经元轴突生长,反而表现出明显的抑制效应,其原因目前尚不明确,是否与梓醇对神经元轴突生长存在双向调节作用有关尚需进一步研究。本研究选用的阳性对照药物胞磷胆碱在临床上应用甚广,通常用于脑卒中功能恢复期,以改善患者的功能预后。但本研究结果发现,1mg·mL-1的胞磷胆碱对离