第四章基因文库的建立-PPT幻灯片

基因文库(genelibrary)基因组文库(genomiclibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)

第一节基因组文库的构建

定义：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。一.基因组文库的规模N—基因组文库克隆总数P—所需机率N=f—插入片段与基因组DNA长度之比

二．建立基因组文库的一般程序

1．载体DNA片段的制备

DNA分离纯化限制酶切脱磷酸化反应

2．供体DNA片段的制备总DNA分离纯化机械剪切法分离特定大小DNA片段酶法部分酶切分离特定大小DNA片段完全酶切

ln（1-P）ln（1-f）

三.

利用质粒载体构建基因组文库该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。四.

利用λ载体构建基因组文库

1.载体DNA片段的制备方法:

左右臂DNA片段的获得

2.供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法

3.重组DNA分子的形成：

控制克分子比率，使其形成串状DNA分子

4.重组DNA分子的包装

1）λDNA的包装物的制备

使用的大肠杆菌菌株：E.coli

BHB2688(N205recA[λimm434cItsb2redEamSam/λ])-包装蛋白E.coliBHB2690(N205recA[λimm434cItsb2redDamSam/λ])-头部蛋白

i.

两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合----本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。ii.

两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单，本底高，可包装不同大小的λDNA分子。2）重组λDNA分子的包装过程包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化加入重组λDNA分子边融化边混合边包装离心除去细胞碎片λ颗粒于-70℃保存待用5.基因组文库的扩增

包装的λ颗粒感染E.coli培养分离λ颗粒-70℃保存五.

利用COS质粒载体构建基因组文库

构建过程与λ载体构建过程相似:两臂DNA片段的制备，供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。为提高文库质量，可采取以下措施：

1.

双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体

2.供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排

3.载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生载体DNAXhoIorSalI酶切补CT连接重组DNA供体DNASau3AI部分酶切补AG

4.采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失利用单COS质粒载体文库利用双COS质粒载体构建基因组文库

七.利用YAC载体构建基因组文库

1.两臂DNA片段的制备:

pYAC4BamHI/EcoRI脱磷酸化

2.供体DNA片段的制备:

琼脂糖凝胶-DNA样品的制备EcoRI部分酶切脉冲场凝胶电泳片段回收和纯化

3.DNA的连接

4.重组DAN分子的转化:原生质体转化法

5.转化子的保存:单菌落保存于96孔平板中酵母人工染色体构建建立基因组文库的载体

A鸟枪法5目的基因的克隆与基因文库的构建鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略

随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离

鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断

超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：

片段长度不均一，粘性末端便于连接，但可能使基因断开。部分酶切：

片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整

与载体连接

如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体转化受体细胞

如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子

菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率

使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA

鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0

kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接在连接前将DNA片段进行分级分离

2.0kb1.6kb1.8kb鸟枪法操作的改进冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法凝胶DNA片段回收技术

鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构第二节cDNA文库的建立定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。一．cDNA文库的特点

1.基因特异性常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，10—15%tRNA

2.器官特异性不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同4.不均匀性

在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。

5.各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）3.代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同

二.cDNA文库的规模N=f为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部cDNA（mRNA）分子数目之比三.建立cDNA文库的一般程序

1.载体DNA片段的制备2.多聚（A）RNA的分离与纯化3.双链cDNA的合成

1）单链cDNA的合成：反转录法2）第二条cDNA的合成：碱解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子ln(1―p)ln(1―f)

RNaseH酶解取代法cDNA法克隆目的基因的基本战略mRNAcDNA第一链的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPscDNA第二链的合成

煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1cDNA第二链的合成

DNApoldNTPsRNaesH置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1AAAATTTOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH3’AAAAAAAAAAAAAA

5’5’TTTTTTTTTTTTTT

3’3’T4-DNAligasecDNA第二链的合成

dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

HO5‘ppp’5G

G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’