考研科目,动物生物化学 第17章 核酸技术

第17章核酸技术DNA重组技术基因操作的主要技术核酸技术的应用生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了“硕鼠”（1）重要的工具酶（2）载体（3）DNA重组的过程1DNA重组技术（1）重要的工具酶

它能够识别、切割双链DNA分子中的特定序列，这些特定序列多数为反向重复序列，一般长度是4、5或6bp。

①限制性内切酶粘性末端：识别序列对称轴，左右两边切开，形成凸出部分。

如

EcoRI:5’---GAATTC

CTTAAG---3’

5’－GGCC－3’3’－CCGG－5’HaeⅢ平头末端：识别序列中间切开同裂酶：产生相同的切割，形成相同的末端同尾酶：识别不同的序列，形成相同的末端②DNA连接酶

相邻DNA的5′磷酸基团和3′羟基形成磷酸二酯键。目前使用的连接酶有两种：大肠杆菌DNA连接酶：黏性末端连接；

T4连接酶：黏性和平齐末端连接。③碱性磷酸酶催化DNA和RNA5′－磷酸基团水解，产生5′－羟基末端，减少载体自身的环化。（2）载体

能将外源DNA带入宿主细胞，进行复制扩增或最终使外源基因得以表达的自主DNA，称为载体（vector）。分为：

①克隆载体：用于基因的复制、扩增、测序等；②穿梭载体：原核与真核细胞间遗传物质的转移；③表达载体：用于目的基因的表达。

（3）DNA重组的过程

①

目的基因的获得

②

选择和制备载体③将目的基因与载体进行切割连接④将重组体导入受体细胞

⑤

阳性克隆的筛选和鉴定

⑥DNA重组体的扩增、表达等研究目的基因克隆的基本过程①目的基因的制备直接从染色体中分离人工合成逆转录合成cDNA构建基因文库

PCR扩增②

载体的选择和制备

原核生物常用的载体：质粒和噬菌体；真核生物常用的载体：动物病毒、酵母；穿梭载体：通常是指那些既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。③目的基因与载体的酶切与连接④

重组DNA导入宿主细胞大肠杆菌、酵母、真菌及各种真核细胞、受精卵细胞都可用于重组。

转化

转染--------

（1）转化：将质粒或重组质粒导入宿主细胞的过程。（2）转导：通过噬菌体或病毒的感柒作用将外援基因导入细菌的过程。（3）转染：噬菌体、病毒为载体构建的重组体导入宿主细胞的过程。⑤

目的基因的筛选和鉴定遗传标记法核酸杂交法PCR方法免疫学鉴定物理筛选遗传学方法（表型）

利用载体的特殊标记,如质粒含有抗青霉素的基因，当含外源DNA的质粒转化后可在含有青霉素的培养基中生长，而未转入质粒的细菌在同样的条件下不能生长。分子杂交技术Southern-blot印迹杂交原理示意图

菌落原位杂交23626③聚合酶连锁反应（PCR,DNApolymerasechainreaction）DNA核苷酸序列分析

Sanger双脱氧链终止法④酶切鉴定目的基因表达

⑥

3DNA技术的应用

(1)DNA指纹技术(2)转基因动物与动物克隆

(3)基因诊断与基因治疗

(1)DNA指纹技术(DNAfingerprint)

DNA指纹技术是20世纪70年代末发展起来的遗传标记（geneticmarker）的方法。

遗传标记是指可用来区分不同群体或个体，又能稳定遗传的某些物质。生物个体间的差异在本质上是DNA的差异，因此DNA是最可靠的遗传标记。

①限制性片段长度多态性

（restrictionfragmentlength

polymorphism，RFLP）

真核生物的DNA分子很长，在遗传过程中DNA碱基由于替换、重排、插入、缺失等原因，在子代DNA中会引起差异形成多态性。

用一种限制性内切酶去切DNA时，DNA分子会降解成许多长短不等的片段，个体间这些片段是特异的，可以作为某一DNA的标记，将这种方法称为限制性片段长度多态性。

在人体DNA文库中发现的由9–70bp重复单位串联重复排列而成的高变异区，称为小卫星DNA（minisatelliteDNA）。

所有真核生物基因组中还存在由2-6bp为重复单位的重复顺序，因其重复单位比小卫星短，称为微卫星DNA（microsatelliteDNA）。

②

DNA指纹图谱（DNAfingerprint）。

不同个体的多态性来源于重复单位的重复次数不同。同一家族小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列，用某一小卫星DNA作探针，可与同一或不同物种多酶切DNA片段杂交，获得高度个体特异性图谱称DNA指纹图谱。

人的DNA指纹图谱DNA指纹图谱的特点：

①一次能够检测十几个、甚至几十个位点的变异性，有效的反应组织的特异性。

②具有很高的变异性。

③

DNA指纹图谱谱带从亲代遗传给子代，儿女的指纹图谱中几乎每一条的图谱中找到。

④

DNA指纹图谱具有体细胞稳定性，从同一个体不同组织。③

随机扩增多态性DNA（RandomlyAmplifiedpolymorphicDNA，RAPD）

是以9–10个核苷酸的随机序列作引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。产物电泳后紫外观察，不同个体的图带差异明显，如DNA指纹图谱一样。

(2)转基因动物与动物