第八章 目的基因的分离克隆

第八章目的基因的分离克隆

第一节PCR技术在植物基因克隆中的应用第二节基因文库技术分离目的基因第三节mRNA差别显示技术分离差别表达基因第一节PCR技术在植物基因克隆中的应用PCR技术直接扩增克隆目的基因

PCR技术克隆已知序列旁侧的未知片段

PCR技术克隆新的未知基因一、PCR直接扩增克隆目的基因PCR直接扩增克隆是一种参考已知基因序列克隆基因的方法。目前已知很多植物基因的序列，当克隆类似基因时，可先从Genebank库中找到有关基因序列，用PCR方法克隆不同植物的基因。

一）从基因组DNA扩增目的基因根据已知基因的序列，设计并合成一对引物；（知道氨基酸序列，可以根据推测的碱基序列设计简并引物）从植物中提取DNA进行PCR扩增；扩增片段的纯化；酶切纯化的扩增片段及载体，并回收酶切片断；将两片段用连接酶连接；重组体转化大肠杆菌；用酶切分析和序列分析检测重组子，并与已知基因序列进行比较；

二）从cDNA中扩增目的基因（RT-PCR）对己知cDNA序列的目的基因可通过RT-PCR技术得到其所需片段。cDNA第一链的合成应根据mRNA序列的复杂性及所扩增区域的特性不同选取适宜的反转录酶和引发的引物。采用合理的策略和技术路线进行。当反转录完成后，以反转录所得的cDNA第一链为模板，特异引物进行特异性PCR扩增。cDNA合成的引物

cDNA第一链的引物主要由RT-PCR的特定用途所决定，可由三种反式引发：以oligo（dT)为引物可与mRNA分子3‘末端的poly（A）序列相结合，有效的引发cDNA第一链的合成，对mRNA具有高效的特异性；对较长序列的mRNA（大于3kb）分子，则较难得到全长的cDNA。

以随机六聚体的核苷酸为引物1）当特定mRNA中由于含有使反转录酶终止反应的序列；2)mRNA分子较大且3‘端非编码区序列较长难以得到全长序列的cDNA或完整的读码框时。当使用随机引物时，cDNA第一链的合成可能起始于mRNA上的许多部位，从而保证得到mRNA的编码区和5‘端旁侧；所有的RNA都可以作为cDNA第一链合成时的模板。以特异的寡核苷酸为引物

PCR反应采用两个特异引物，cDNA第一链的合成与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用特异引物引发cDNA第一链合成的好处是仅产生需要的cDNA，并导致更为特异的PCR扩增。用RT-PCR扩增目的基因的方法二、PCR克隆已知序列旁侧的未知片段cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。在分离一种新转录的cDNA拷贝时，往往得到的cDNA克隆只是原mRNA的部分序列。运用反向PCR、锅柄PCR(PanhandlePCR)、连接介导PCR等PCR技术及cDNA文库筛选技术为扩增已知序列旁侧的未知DNA片段提供了捷径。然而,这些方法实验周期长、费用高，而且常出现PCR扩增效率或特异性低等问题。因而利用这些方法很不容易得到完整的全长基因，尤其是基因的5′-端。cDNA末端的快速克隆（RACE技术）

一）经典RACERACE技术是通过以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后，用PCR方法实现从基因内部某个特定位点到3‘端或5’端之间未知序列克隆，因而有5‘－RACE和3’－RACE。

3’－RACE策略：以带有Q0、Q1引物序列的oligo（dT)的引物QT为反转录引物合成cDNA第一链以Q0和基因特异性引物（GSP1）进行首次PCR扩增以Q1和基因特异性引物（GSP2）为巢穴引物进行嵌套式PCR扩增，获得所需的3‘端目的片段。

5‘-RACE策略：以基因特异引物（GSP-RT）将mRNA特异性反转录为cDNA第一链；在cDNA第一链3‘端加入poly（A）尾；以QT和GSP1进行首次扩增；以Q1和GSP2进行第二次扩增，最后获得5‘端目的片段。经典RACE原理示意图二)新RACE一般的5‘－RACE技术中存在的最困难的一步诱导反转录酶将目的mRNA反转录成完整的cDNA第一链。经典RACE中反转录过程的提前终止导致非全长第一链cDNA的多聚腺苷化，并在PCR中全部扩增，全部cDNA在PCR中均能扩增，产生非全长cDNA5’末端，从而给实验带来一定难度。新RACE技术不同之处在于，锚定引物在反转录之前就连接到mRNA的5‘末端，因此，只有通过目的mRNA5’端全长的反转录物，锚定序列才能整合到cDNA第一链中.基本原理用牛小肠磷酸酶（CIP）对mRNA脱磷酸化，脱磷酸化的作用只对降解的mRNA有效而对全长的mRNA无效；用烟草酸性焦磷酸酶（TAP）处理全长mRNA使其脱帽，即可使全长mRNA5’端带上活化的磷酸基团；用T4RNA连接酶将其与一段由线性化质粒体外转录产生的特异RNA寡核苷酸相连；用基因特异引物或随机引物对RNA寡核苷酸－mRNA杂合体进行反转录产生cDNA第一链；用基因特异引物和RNA寡核苷酸特异引物进行PCR扩增，从而获得5‘端未知序列。新RACE与经典RACE比较新RACE图示第二节基因文库技术分离目的基因

基因文库的类别植物核基因组文库构建植物cDNA文库构建利用PCR技术构建植物cDNA文库一、基因文库类别基因文库：是指某一生物类型全部基因的集合。（这种集合是以重组体形式出现）某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑）即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合即为该生物的基因文库。

意义：使生物的遗传信息以稳定的重组体形式储存起来；分离克隆目的基因的主要途径；是复杂基因组作图的重要依据。文库分离目的基因的主要内容：基因的克隆；克隆基因的分离；分离基因的鉴定。

一）类别根据基因类型分：基因组文库和cDNA文库；根据文库功能分：克隆文库和表达文库；根据构建文库的载体分：质粒文库、噬菌体文库；黏粒文库；人工染色体文库。基因组文库：是指某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。两者区别：

cDNA文库具有时效性

cDNA文库只反应mRNA的分子结构克隆文库：由克隆载体构建。载体中具有复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片段大量增殖。表达文库：是用表达载体构建。载体中除克隆文库的元件外，具有控制基因表达的序列（如启动子、SD序列等），可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物筛选：从克隆文库分离某的基因主要利用核酸探针；从表达文库分离某的基因除利用核酸探针外，还可以利用免疫学探针及生物功能进行筛选。二）文库构建的基本程序植物DNA提取及片段化，或cDNA的合成；载体的选择及制备；DNA片段或cDNA与载体连接；重组体转化宿主细胞；转化细胞的筛选；二、植物核基因组文库构建主要使用λ噬菌体置换型或黏粒载体（柯斯载体）随机文库克隆数目N=ln（1－P）/ln（1－X/Y）如：小麦基因组1.5x1010，在文库中找到任一序列的概率不低于99％，则构建的基因组文库的克隆数目应不少于4.1x106植物基因组大小及克隆文库所需噬菌斑数1、基因组DNA的片段化随机片段可通过机械切割或限制酶局部消化产生。机械切割可获得较为均一的随机片段，但片段不能直接用于克隆，须经末端修饰，连上接头后产生粘性末端才可以；限制酶局部消化可直接产生粘性末端，但片段的随机性较差。一般采用Sau3AI（和BamHI同尾酶）在λ噬菌体载体上构建基因组文库植物基因组文库构建技术流程2、核基因组文库构建的技术说明较理想的置换型载体有EMBL、3EMBL4、2001等，能容纳23kb外源片段，具有Spi¯正选择表型。载体臂的制备：用两个靠近的限制酶进行双酶切，防止填充片段与臂的重新连接。DNA插入片段的制备：控制反应时间及酶量；防止酶切后的片段重新连接；1）碱性磷酸酶除去5‘末端磷酸基团，2）Klenow酶的凹陷末端不完全补平。三、cDNA文库构建步骤：细胞总RNA提取并分离纯化mRNA；

合成cDNA第一链；将mRNA－DNA杂交分子转变成双链cDNA；

双链cDNA的修饰；

双链cDNA重组到载体上。一）RNA提取及

mRNA的纯化用纤维素柱纯化mRNA的流程示意图二）合成第一链cDNA

oligo（dT）引导的cDNA合成法；随机引物引导的cDNA合成法；

三）mRNA-DNA杂交分子变为双链cDNA自身引导合成法：用碱处理使mRNA模板水解，从而导致第一链cDNA解离，并在其末端形成一个发夹结构，以此为引物合成cDNA第二链，用S1核酸酶切割除去发夹环结构。置换合成法：大肠杆菌RNaseH能够识别mRNA－DNA杂交分子，将其中的mRNA模板消化成许多短片段，以这些mRNA短片段为引物，利用原来的cDNA为模板合成第二链cDNA，通过连接酶连接成完整的双链cDNA分子。

oligo（dG）引导合成法：在第一链cDNA分子尚未与mRNA模板分离之前，先在其3‘－末端加上一段oligo（dG）序列，然后通过碱性蔗糖梯度离心处理，使mRNA模板分子发生水解作用，回收全长的cDNA，以互补的oligo（dG）序列作引物引导第二链cDNA的合成。cDNA合成过程四）cDNA链的末端修饰合成的cDNA克隆前要经末端修饰，使之能与载体的相应末端连接。同聚物加尾：利用末端转移酶在DNA分子3‘－OH加上一系列同种脱氧核苷酸。一般采用cDNA加上oligo（dC），载体加上与之互补的oligo（dG）。加接头：利用T4DNA连接酶将接头连接到cDNA平末端，（非平端可用Klenow补平），用限制酶进行消化，产生带粘性末端的cDNA。（此法须用甲基化酶对cDNA中的酶切位点进行保护或采用罕见的接头）

加衔接头（子）：五）cDNA克隆载体用于植物cDNA文库构建的λ噬菌体载体主要有λgt10、λgt11等λgt10为免疫区插入型克隆载体，克隆位点位于cI基因内，可以通过清亮噬菌斑（重组型）和混浊噬菌斑（非重组型）进行筛选。文库用核酸探针筛选。λgt11为－半乳糖苷酶失活型载体。克隆位点位于lacZ基因内，可以通过蓝斑（重组型）白斑（非重组型）进行重组体筛选。文库即可用核酸探针筛选，也可用免疫学探针（抗体探针）进行筛选。以质粒为载体构建cDNA文库以λ噬菌体为载体构建的cDNA文库流程图四、利用PCR技术构建植物cDNA文库cDNA文库构建的起始信息物质是mRNA，植物细胞中mRNA含量较低，对于低丰度的mRNA，要通过富集或增大克隆数目来保证构建的文库中能含有所需克隆。用PCR技术构建植物cDNA文库优点：能够从极有限的起始材料中构建cDNA文库；可以以总RNA为模板合成cDNA，无需mRNA的纯化，且避免低丰度信息分子的丢失；能够提高cDNA文库的完整性；末端转移酶加尾法扩增cDNA寡核苷酸衔接子法扩增cDNA五、基因文库筛选方法从文库中筛选目的基因的方法主要有：核酸杂交法；免疫学检测法；PCR筛选法等核酸杂交法适用于大量群体的筛选，可同时快速筛选克隆数目很大的文库。对已知部分序列的目的基因的克隆，使用按已知信息合成的寡核苷酸探针；分离植物同源基因时，可根据保守序列合成同源探针；免疫学检测使用抗体探针，通过检测重组克隆表达出的蛋白质来筛选目的克隆。抗体探针只适用于表达文库的筛选，且只能筛选出表达了的克隆。PCR筛选法是通过混合克隆的PCR，以尽可能少的PCR反应次数从含成千上万个克隆的基因文库中筛选出目的（阳性）克隆。基因文库PCR筛选的“反应池”示意图第三节mRNA差别显示技术分离差别表达基因一般真核生物基因的总数是10万个左右，在生物的一定发育阶段或在某一类型的细胞中，大约只有15％的基因得到表达。基因的差别表达是生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式。基因的差别表达是决定细胞分化的基础，无论是正常的代谢变化还是非正常的变化，无论是由单基因还是由多基因控制的，这种变化都是由于基因表达的改变所引起的。1992年美国的liang和Pardee首次提出mRNA差别显示技术。mRNA差别显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速并行之有效的方法之一，简称DDRT-PCR。是将mRNA反转录技术与PCR技术相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。一、mRNA差别显示技术的基本原理真核生物基因中绝大多数mRNA在3‘末端都有poly（A）尾巴结构，利用这一特征设计3’端锚定引物，将mRNA分成不同的群体。锚定引物的通式是oligo（dT）12MN，这样共有12种oligo（dT）12MN引物，用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成。每一种3‘端锚定引物，都能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。（DDRT）代表特异性表达基因的杂交分子在全部杂交分子中所占比例很低，须用PCR扩增放大后进行比较，才可能把它们从庞大的群体中分离出来。另外需要一种10个核苷酸组成的5‘端随机引物。用3’锚定引物和5’随机引物组成的引物对，以mRNA－cDNA为模板进行PCR扩增，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以显示50－100条长度在100－500bp的DNA条带

若用12中3‘锚定引物和20种5’随机引物组成的240组引物进行PCR扩增，可以得到20000条左右的DNA条带，能覆盖一定发育阶段某种类型细胞中所表达的全部mRNA种类的96％。不同组织样品的同一类cDNA的PCR选择性产物在凝胶电泳上的差别表现在同一迁移位置上条带的有和无、条带所含分子数目的多少。条带的有无反映出组织特异性表达基因的“开”与“闭”，条带所含分子数目多少则是mRNA剂量效应的一种体现。二、mRNA差别显示

技术的基本程序三、mRNA差别显示技术优点及局限性优点：简便性在技术上主要依靠PCR扩增和聚丙稀酰胺变性凝胶电泳灵敏度高丰度较低的目的mRNA通过调整引物，进行P