兽医公共卫生学：病原微生物分子检测及分子分型

病原微生物的分子检测及分子分型浙江大学动物科学学院方维焕教授方春博士生分子诊断技术分子分型溯源技术Contents聚合酶链反应技术(PCR)核酸分子杂交技术噬菌体表面展示技术核糖体分型（ribotyping）脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）多位点序列分型（MLST）基于PCR的分型技术分子诊断一：聚合酶链反应技术(PCR)DrMullis(1993年诺贝尔化学奖）。

94℃变性50-65℃退火XX℃延伸基本原理模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+PCR反应体系TaqP1P2dATPdTTPdGTPdCTPMg2+PCR反应成分和其对反应的影响APCR反应的缓冲液

是重要影响因素，特别是其中的Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。一般为1.5-2.0mmol/LMg2+是比较合适的。B底物

浓度过高会增加碱基的错误掺入率，过低导致反应速度的下降。4种dNTP在使用时必须以等量浓度配制。C酶（TaqDNA聚合酶）

其浓度过高，可引起非特异性产物的扩增，过低则合成产物量减少。一般100uL反应体系中酶的用量为0.5-5U。D引物

为最关键的因素。浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且增加引物二聚体的机率。浓度一般为0.1-0.5umol/L。E.模板DNA

DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR技术的特点1）高度的灵敏性2）特异性引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。3）操作简便易行只需要数小时,就可以扩增出DNA。引物设计原则（1）序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列；（2）引物长度以15-40bp为宜；（3）碱基尽可能随机分布，G+C占40-60%；（4）引物内部避免形成二级结构；（5）两引物间避免有互补序列；（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。常用PCR反应类型常规PCR多重PCR套式PCRReal-timePCRM12341000bp500bp250bp1500bp459bp688bp532bp750bp猪链球菌2型PCR扩增产物电泳图定性PCR定量PCR台州Vp双重PCR鉴定电泳图实时定量PCR常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR原理---------扩增曲线DNA产物的荧光标记非特异性荧光标记：

1、SYBRGreen特异性荧光标记：

2、TaqMan3、MolecularBeacon

SYBRGreen法工作机理SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位

SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreenSYBRGreen法熔解曲线分析熔解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确熔解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物SYBRGreen法-PCR反应的建立反应体系的建立及优化:SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同SYBRGreen法优缺点对DNA模板没有选择性

----适用于任何DNA

使用方便

-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点方法2-TaqMan法5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等；

3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)；探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光；

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针；TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan法PCR反应的建立1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：

一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度

72℃，45S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值引物浓度：50-900nM

探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同TaqMan法优缺点对目标序列的高特异性

------阴性结果确定设计相对简单

------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点分子诊断二：核酸分子杂交技术核酸分子杂交的基础：分子单链之间的互补碱基通过非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。核酸探针的种类根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，cRNA探针及寡核苷酸探针等几类；DNA探针DNA探针指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列。这些DNA片段须是特异的。探针制备建立细菌基因组DNA文库，获得细菌特异的核酸探针。建DNA表达文库，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段DNA探针的优点这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记

固相膜核酸分子杂交方法DNA的分离、变性变性DNA转膜至硝酸纤维素膜洗膜、干燥、固定预杂交液浸泡加入探针杂交洗膜结果显示SouthernBlot操作流程DNA芯片在固相支持物上原位合成(insitusynthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。DNA芯片技术的优势①基因诊断的速度显著加快，一般可于30min内完成。若采用控制电场的方式，杂交时间可缩至1min甚至数秒钟②检测效率高，每次可同时检测成百上千个基因序列，使检测过程平行化。③基因诊断的成本降低。④芯片的自动化程度显著提高，通过显微加工技术，将核酸样品的分离、扩增、标记及杂交检测等过程显微安排在同一块芯片内部，构建成缩微芯片实验室。⑤因为是全封闭，避免了交叉感染；且通过控制分子杂交的严谨度，使基因诊断的假阳性率、假阴性率显著降低。

分子诊断三：噬菌体展示技术以改造的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性质的多肽/蛋白质，并实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术。噬菌粒的构建分型技术传统表型分析法

传统的分型技术主要根据病原菌的外在生理、生化特性等表型进行分型的，主要有血清分型、噬菌体分型、多区带酶电泳分型、酯酶分型等。尽管传统的分型技术应用比较广泛，但区分度低、重复性差、标准型难仍是其制约因素。

分子(或DNA)分型法相对于传统的分型方法，分子分型具有高分辨率、可重复性，易于标准化及自动化，主要有一下方法：脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）多位点序列分型（MLST)核糖体分型（Ribotyping）基于PCR的分型技术

分子分型一：脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）PFGE通过选择特定的限制性内切酶，将细菌DNA切成8-25条大小为40-600kb的条带，然后通过不断变换电流方向，使各条带得到较好的分离。细菌的染色体稀有酶切位点限制性内切酶消化电泳PFGE分型重复性好，分辨率强，目前分子分型的“金标准”；方法在技术上较复杂，需要特殊的仪器以及操作时需要较长的时间，约需2-3天。分子分型二：多位点序列分型（MLST）对多个基因或基因片段进行测序来确定细菌的亚型及各分离株之间遗传相关性的分型方法。与PFGE及核糖体分型相比，MLST结果明确而且便于解释。

MLST分型方法实验流程病原菌检测鉴定

增菌培养基因测序序列分析可靠序列数据分析

结果结论看家基因扩增分子分型三：核糖体分型Theprincipleofribotyping核糖体分型是利用Southern印迹分析来检测与核糖操纵子有关的多态性。DNA由限制性内切酶消化，并经琼脂糖凝胶电泳，分开的限制性片段转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，加上标记探针，这样即可检出含细菌rRNA基因的限制性片段。

分子分型四：基于PCR的分型技术随机扩增DNA多态性分析分型（RAPD）PCR-限制性片段长度多态性分析分型（PCR-RFLP）扩增片段长度多态性分析分型（AFLP）重复片段PCR分型（REP-PCR）MLMLNLVLWLSLGLGLM3PCR方法鉴定不同种李斯特菌iaplmo0036lmo0041PCR扩增条件94℃3min94℃30s55℃30s72℃1min72℃10min