第7章-2 基因表达的调控-真核 精简版

第7章基因表达的调控21第三节真核细胞的基因表达调控真核生物基因表达调控的位点更多2真核生物基因的表达调控方式比原核的更加复杂，表达的基因中除了少部分是对外界环境发生变化的快速反应表达外，大部分是属于调控生物发育的基因。3在真核生物基因的表达控制中，各基因间的正确协调是非常重要的调节。43.1染色质水平的调控3.2转录水平的调控3.3转录后水平的调控3.4翻译水平的调控3.5翻译后水平的调控第三节真核细胞的基因表达调控53.1染色质水平(转录前)的调控染色质水平的调控属于转录前调控,低等真核生物一般通过将染色质DNA加工改造的方式来调节,高等生物一般将不再需要的基因所在的染色质异质化,使其永久关闭,但是也有基因重排出现。63.1.1染色体丢失3.1.2基因扩增3.1.3染色体DNA序列重排3.1.4染色质DNA的修饰和异染色质化染色质水平调控的几种常见方式7如蛔虫、四膜虫、小表瘿蚊、甲壳类的剑水蚤等中出现的染色体丢失。3.1.1染色体丢失除了保留一个细胞（生殖细胞）中的染色体完整外，其余参与分化的细胞中的染色体逐渐减少，甚至减少一半。哺乳动物细胞中红细胞细胞核消失8马蛔虫受精卵的早期分裂小麦瘿蚊的染色体丢弃9通过改变基因的数量来使基因表达增加的调节方式，在短时间内使某一种基因数量的拷贝大量增加。3.1.2基因扩增(果蝇)灯刷染色体、多线染色体等10果蝇的多线染色体11卵母细胞中为将来受精卵的发育蛋白质合成准备了大量的核糖体，专一性扩增rDNA(编码核糖体RNA的基因)，到受精卵发育后期才逐渐消失。12原核生物中沙门氏细菌的相转变Mu噬菌体G片断的倒位3.1.3染色体DNA序列的重排真核生物中

免疫球蛋白在成熟过程中的重排

酵母的交配型转变

锥虫VSG表面糖蛋白的重排13锥虫（trypanosomes）的表面抗原(一种糖蛋白)更是千变万化，用以逃脱宿主免疫系统的攻击，这也是通过一系列DNA重排达到的，其复杂程度有点类似于抗体基因的结构。1415抗体的产生（DVJ重组）脊椎动物和人的淋巴细胞在其成熟过程中抗体基因的重排，是有关基因重排研究中一个最重要的实例。每一个浆细胞只能产生一种或几种抗体，无数由淋巴细胞分化而来的浆细胞就能产生无数种类的抗体分子。20世纪60年代提出体细胞重组学说试图解释抗体种类多样的原因，1976年由利根川进证实。16抗体的结构重链(H)轻链(L)可变区(V)恒定区(C)抗体分子分别由三个独立的基因族编码，其中两个(κ和λ)编码轻链，一个编码重链。17小鼠的κ和λ和重链分别位于第6、16和12号染色体上。决定轻链的基因族上分别有L、V、J、C四类基因片段。L代表前导片段(leadersegment)，V代表可变片段(variablesegment)，J代表连接片段(joiningsegment)，C代表恒定片段(constantsegment)。决定重链的基因族上共有L、V、D、J、C五类基因片段，其中D代表多样性片段(diversitysegment)。在J和C片段之间存在增强子(enhancer)。18抗体基因可通过倍增和歧化来增加其数量，在种系中基因数目有较大变动，因此难于确定。19小鼠λ链基因V片段数异常少，可能是其在过去曾遭剧变而丢失大部分的V片段。轻链的恒定区只1个，但λ链每个J片段都与其本身C片段相连。20除淋巴细胞外，所有细胞免疫球蛋白基因族的结构都是相同的，称为种系结构，只有骨髓干细胞在分化为成熟B淋巴细胞的过程中才出现免疫球蛋白基因的体细胞重排(somaticrearrangement)。利根川进(SusumuTonegawa)揭示了抗体基因重排机制，因而获得1987年诺贝尔生理学和医学奖。21SusumuTonegawa22在B细胞分化过程中，首先出现免疫球蛋白基因位移，然后才进行重排。重排具有严格的顺序，第一次重排发生在前B细胞中，最先由编码免疫球蛋白重链的基因族片段参与重排，使在种系中相互分离的片段经重排后连接在一起，称为V-D-J连接。其间，D片段与J片段先连接，接着V片段加到D-J上，形成V-D-J复合体。23免疫球蛋白重链基因的重排(V-D-J连接)24重排中选择的片段是随机的，片段之间序列在重排中被删除。重链重排后接着是轻链κ链基因重排，形成V-J复合体。只有κ链基因重排失败，才发动λ链基因重排，故抗体中大部分轻链是κ链，λ链只占少部分。淋巴细胞在繁殖过程中还发生体细胞突变，从而增加了抗体的多样性。25免疫球蛋白轻链基因的重排(V-J)26酵母的交配型转变27酿酒酵母是单细胞生物，一般以营养体形式进行出芽生殖。营养体是单倍体或二倍体，单倍体可以进行出芽生殖，单倍体有2种类型：a型和α型，两个不同类型的单倍体细胞相互结合，形成二倍体营养细胞，进行出芽生殖或减数分裂，形成4个单倍体的孢子，其中2个为a型，2个为α型。2829酵母结合型的决定是由结合型基因MAT决定。1949年发现酵母的结合型有相互转变的现象。其实在酵母的基因组中含有a型或α型的基因信息，但是只能表达其中的一种。303.1.4染色质DNA的修饰和异染色质化染色质中，凝缩状态的染色质为异染色质，其中的基因永久关闭，为非转录活性区。目前发现，DNA的碱基修饰（如甲基化等）是基因表达控制的一种重要手段。31CpG中C中的C5位置的甲基化是真核生物DNA中最为重要的一种修饰方式，可以对基因的转录产生影响，进而调节基因的表达。32真核生物的DNA中大约2－7％的胞嘧啶C被甲基化，哺乳动物中CG中的C的甲基化水平比较高，但在基因组中的分布不均匀。33在许多情况下，甲基化的结果使得基因失活，去甲基化后基因恢复活性。34植物”柳穿鱼”中，由于某个基因的DNA序列被甲基化，导致该基因失活，引起植物花型的改变。35但是这种过程不是绝对的，例如在脊椎动物中DNA的甲基化水平较高，但是在果蝇等昆虫中却没有发现有DNA的甲基化修饰。36DNA中的第5碱基甲基化的胞嘧啶37组蛋白的修饰目前发现，组蛋白的修饰方式多达150种，其中最常见的是乙酰化、磷酸化、甲基化等，修饰的结果是使蛋白质表面的电荷发生改变，影响与DNA的结合能力。38如果某段染色体中的基因要表达，表面的组蛋白必须经过修饰，使与DNA的结合变弱，DNA才能与RNA聚合酶或转录调节因子结合，开启基因的转录。39染色体上组蛋白的修饰40组蛋白的修饰方式有150多种，组蛋白中不同Lys可以进行不同方式的修饰，所以组蛋白可以进行修饰的类型是非常巨大的，遗传信息就储存在这些不同的修饰方式中，而与具体的DNA序列无关！41这些组蛋白不同的修饰方式就会影响到染色体的结构以及其中包含的基因的转录活性等。这方面的秘密正在被逐步揭开。42染色体中基因转录活跃部分的核小体中组蛋白的乙酰化程度比较高(超乙酰化)，而基因不活跃区域的组蛋白的乙酰化程度比较低。细胞内的组蛋白乙酰转移酶是属于一种转录激活因子。43与乙酰化过程相反，组蛋白的去乙酰化使基因的转录活性降低。在DNA的复制过程中也发生组蛋白的乙酰化。44组蛋白的甲基化、乙酰化与染色体的活性相关45在染色质水平对基因表达进行调控是真核细胞特有，而原核细胞没有的。46基因组印迹(genomicimprinting)经典的遗传理论认为，在2倍体生物的基因组中，同一位点的等位基因，无论是父源还是母源，其遗传性质和表型特征是相同的。47但是20年前的研究发现，有些动物子代中来自父母的基因在表达上有差异。一些只有来自父源的基因才有活性，来自母源的基因则始终处于沉默状态；而另外一些基因则相反，只有来自母源的基因才有活性，来自父源的基因则沉默。这就是“亲本印迹效应”。48就是说，子代细胞中来自父源和来自母源的基因（一对等位基因）表达模式不同。基因印迹就是指依赖于亲本起源的特殊等位基因上产生修饰，引起等位基因表达不对称的现象。产生印迹效应的基因称为印迹基因。49第一个被鉴定的印记基因是小鼠的胰岛素样生长因子2(igf2)基因,它编码一个重要的胚胎特异生长因子。ifg2基因只有来源父源时才表达，而另外一个基因，6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子2受体基因则表现母源基因表达。50现在,通过定位候选克隆、DNA甲基化和表达父源差异法、基因组扫描等技术,已经发现定位了一系列人类的印记基因。现在已发现多种人类遗传疾病与基因组印记有关。51基因印迹的发生需要多个步骤，基因印迹主要与DNA的甲基化有关。基因的甲基化方式与生物的性别有关，而且可以遗传。52基因印迹和组蛋白修饰都可以显著改变基因表达模式，并且这种改变的基因表达模式还可以遗传。就是说，在DNA复制中，组蛋白的修饰类型和DNA的甲基化方式都受到保留。53这种遗传方式导致的基因表达模式的改变DNA序列无关，称为表观遗传(epigeneticinheritance)。5455同卵双胞胎大聚会56Nature,2010vol464,p135157美国加州大学旧金山分校的塞尔古奥·巴郎奇尼为首的研究小组找到一对同卵双胞胎女性，其中一人得了多发性硬化症。科学家们试图从分子生物学基因等角度寻找发病机制58他们对这对双胞胎的基因组序列进行测序对比，找不到可以解释病因的差异；又检查了基因组的甲基化分布情况，可是也找不到差异。实验失败了，可是结果还能够发表在Nature上。这说明疾病的发病机理不单单是由基因决定了，比我们现在认为的要复杂得多。59其实双胞胎在很多方面有差异。2005年，美国阿拉巴马大学的生物学家JanDumanski研究了19对同卵双胞胎的基因组，发现DNA序列以及基因的拷贝数等方面有很大差异。由于细胞分裂过程中总会有一些基因的突变，这些变化慢慢积累，总数就很可观了。为什么双胞胎越长越不像602005年，西班牙国立癌症研究中心的ManelEsteller证明，基因修饰可以解释同卵双胞胎之间的差异。他们研究了40对不同年龄的同卵双胞胎的基因修饰差异，发现年龄越大的，基因修饰程度的差异越大。而且他们在饮食和环境方面差异越大，甲基化的差异也就越大。61刚生下来的双胞胎呢？也不一样，起码他们的指纹就不一样。同卵双胞胎虽然开始时候的基因一样，但是他们在发育过程中所处的环境总有所差异，接受的外界信息也不完全相同，这些微小的差异，最终慢慢积累放大，导致他们最终成为完全不同的两个人。62所以一个人的基因并不能决定他的未来，只有这样，活着才有意思。633.2转录水平的调控真核生物的转录水平调控也是基因表达调控的主要控制点。由于真核生物有染色体的结构，所以基因的转录首先要使染色体局部疏松化（染色体的活化），便于基因的转录，然后才能使激活蛋白或阻遏蛋白进一步影响基因的活性。64染色体中的基因开始转录之前，因为核小体结构妨碍基因的转录，所以要先经过活化，使DNA变的“疏松”，然后才能开始基因的转录。3.2.1染色质的活化65活化后染色体变的对DNaseI敏感，出现“超敏感位点”。整个染色体的结构随之发生变化。可以使用DNaseI进行检查发现。6667染色体的这种构型变化是基因开始转录前的必要条件，否则基因所在的DNA序列被紧紧包裹，是无法开始转录的。68染色体构型的变化与众多因素有关，至今也没有完全搞清楚。但与组蛋白的修饰有很重大关系。69这种染色体的构型变化叫做“染色体改建”（chromosomeremodeling），这个过程需要许多的酶和蛋白质复合物参与，消耗大量能量。70参与染色体改建的一些酶和蛋白质复合物复合物中任何某种蛋白质的失活或突变都将导致基因无法表达。71染色体的改建只是完成了基因转录的一些基本准备，基因是否转录还有待于众多的DNA序列和蛋白质、RNA之间的相互作用。723.2.2基因的转录调节真核细胞与原核细胞的基因转录不同73原核是负调控系统，真核是正调控系统7475真核生物的RNA聚合酶本身不能发动转录，必须有众多的蛋白质因子（转录因子）协助才能开始基因的转录。76这些转录因子和RNA聚合酶在基因的启动子附近组装成转录起始复合物，才具备基因转录的最低要求。7778我们把参与基因转录过程中的除了RNA聚合酶之外的其他蛋白质称为转录因子（transcriptionfactors）。79根据转录因子作用的方式不同，我们可以将其分为2类：基本转录因子和特异性转录因子。80是指和RNA聚合酶一起，结合在核心启动子上，组成转录起始复合物的那些转录因子。基本转录因子(generaltranscriptionfactor)81RNA聚合酶不管转录什么基因，都需要这些基本转录因子的协助。它们结合在启动子上，形成起始复合物。82RNA聚合酶II转录起始复合物的组装83真核细胞有3种RNA聚合酶，它们需要的基本转录因子各不相同，如RNA聚合酶I的转录因子叫做UBF、SL1；RNA聚合酶II的转录因子叫做TFIIA、TFIIB、C、D....，RNA聚合酶III的转录因子叫做TFIIIA、B、C等等。84基本转录因子(transcriptionfactors)85基本转录因子是RNA聚合酶转录基因时不可缺少的。但RNA聚合酶仅仅具有基本转录因子还不能高效的发动基因的转录，还必须有特异性转录因子的协助。86这些特异性的转录因子结合在基因核心启动子上游的DNA序列上，才能使基因得到高效转录。87真核基因的高效转录需要RNA聚合酶、基本转录因子、特异性转录因子以及上游调控序列、增强子等的协同。88不同基因转录时需要的这些特异性转录因子是不完全相同的，所以称之为“特异性”转录因子，而RNA聚合酶无论转录什么基因，所需要的基本转录因子是相同的。89在基因转录过程中，还存在一些蛋白，它们是在RNA聚合酶复合物与特异性转录因子之间起联系作用，称之为“辅激活因子(co-activator)”，它们不与DNA结合。90真核启动子和调节蛋白91酵母基因转录需要转录因子与RNA聚合酶的协作92常见的其他一些与基因转录有关的概念转录需要的DNA序列包括启动子终止子增强子沉默子绝缘子上游控制元件控制元件应答元件93基本转录因子特异性转录因子反式激活因子辅激活蛋白(激活物)抑制因子转录需要的蛋白质种类94真核细胞RNA聚合酶II的启动子区域的保守序列：－70~－80：CAATbox，CCAAT－80~－110：GCbox，GCCACACCC或GGGCGGG－25~－35:TATA区更上游的区域还可能有增强子等序列95真核细胞基因的启动子序列96一般来说，TATA区的主要作用是使转录精确起始,TATA区突变的结果会使基因在不同的地方起始转录.97而CAAT区和GC区的主要作用是控制基因转录的起始频率，基本不参见转录的起始具体位置。其中CAAT区的任何一个碱基的改变都会时基因转录强度下降。98启动子序列对基因转录起始重要性分析99真核细胞的调控区范围较大，核心启动子上游-40到-110区属于上游激活区,在更上游的区域，许多基因还含有GC区和增强子区。这些区域内均有可能有蛋白质因子结合在DNA序列上促进基因的转录。100一般将TATA区域上游的保守序列称为上游启动子元件（UPE）或上游激活序列（UAS）以及上游控制元件等。101原核细胞的保守区一般是：－10区：6bp，TATAAT，Pribnowbox，有助于DNA双链的解开－35区：TTGACA，叫做识别区，是σ亚基识别DNA序列的位置。比较102原核细胞的启动子范围比较小，一般Pribnow区的中心位于-7到-10，上游-30到-70为正调控因子结合的序列，＋1到-20一般是负调控因子结合的序列。比较103转录起始点上游区的结构比较104基因的转录实际上是RNA聚合酶、转录因子和启动子区各种元件相互作用的结果。105同一基因有多个不同的启动子同一基因有强弱不同的多个启动子，在不同状态下使用不同的启动子，从而控制基因表达的强弱。106这种情况在噬菌体中较为常见，但在真核细胞中也存在。小鼠的唾液、肝脏、胰脏中均可以合成α-淀粉酶。但是它们合成的量是不同的，唾液中的淀粉酶的含量是肝脏中的100倍。编码α淀粉酶的基因据有2种不同的启动子。107转录因子的结构特征这里所说的转录因子是指特异性的转录因子，它们与启动子、上游调控元件、增强子等中的特殊序列结合而对基因的转录起增强作用。108转录因子因为要和DNA、蛋白等相互作用，自身还要形成二聚体等结构，所以一般都含有多个结构域(domains)a与DNA结合的结构域b与蛋白质结合的结构域c激活结构域109转录因子要与多种分子相互作用110这种基序由20个左右的氨基酸组成，2个成直角的α-螺旋被一个β-转角分开。在大肠杆菌的lacrepressor、trprepressor和CRP中含有这种结构域。2个α-螺旋中的一个伸进DNA的大沟里与DNA作用。这种识别有非常高的特异性，在实验中发现，即使有一个氨基酸残基的改变也会引起识别特点的变化。转录因子与DNA结合的结构域特征(1)Helix-turn-helix基序（螺旋-转角-螺旋）111红和橙色为基序(motif),兰色为DNA,灰色是蛋白质结构域(domain)中的一部分Helix-turn-helix基序112113(2)锌指结构(Zincfingerdomain)锌指是根据其结构命名的，在蛋白质中，有一小段保守的氨基酸与锌离子结合，形成一个相对独立的区域。有两类DNA结合蛋白质含有这种结构：经典的锌指蛋白和类固醇受体。114锌指本身包含大约23个氨基酸残基，一连串的锌指之间有7－8个氨基酸残基连接，有的转录因子含有9个锌指结构，而有的只有2个锌指。115锌指的C端形成α螺旋，N端形成β折叠，α螺旋与DNA相互作用，3个锌指的α螺旋恰好等于DNA大沟的一圈。116锌指是DNA结合基序，含有的α螺旋与DNA的大沟作用。117典型的锌指蛋白含有一连串的锌指，根据伸出锌指结合位点的氨基酸环将锌指分分为2种：Cys2/His2锌指和Cys4锌指。118119转录因子SP1有一连串的锌指结构120老鼠的转录因子zif-268有3个锌指结构121类固醇受体中含有锌指结构122一般含有多个锌指结构的蛋白质有可能是转录因子。123转录因子的蛋白质相互作用结构域(1)亮氨酸拉链(Leuzipper)参与蛋白质二聚化

蛋白质中，由一连串Leu组成的一种结构，Leu在螺旋中有规律的出现，形成一个疏水表面，蛋白质形成二聚体时就是通过这个疏水表面的相互作用。124许多转录因子是通过形成二聚体而发挥作用的。125转录因子的2个亚基通过亮氨酸拉链结合在一起126螺旋-环-螺旋(HLH)基序由40－50氨基酸残基组成，含有2个两性α螺旋，每个螺旋由15－16个氨基酸残基组成，它们被一个环隔开。螺旋负责蛋白质二聚体的形成。(2)螺旋-环-螺旋基序127整体结构与Leuzipper类似，只是中间被loop环分开。两性螺旋一侧是疏水区，可以促进蛋白质的结合(与Leu拉链结构类似)，另一侧的带电的碱性氨基酸可以与DNA结合。所以这种结构又被称为bHLH基序。在转录因子MyoD中有这种结构。128转录因子具有激活基因转录的作用，所以转录因子本身还含有与激活有关的结构域。目前对这部分内容有了一定的了解，但是还不多。转录激活结构域129如酵母的转录因子Gcn4和Gal4、哺乳动物糖皮质激素受体、肝炎病毒激活VP16等激活结构域中含有较多的酸性氨基酸，故名。但是否仅有这种酸性结构域就可以激活基因的转录，还是需要什么其他的特定元件目前还不清楚。酸性结构域(Acidicactivationdomain)130富含谷氨酰氨结构域(Glutamine-richdomains)在SP1中发现，其中Glu的含量似乎比其整体结构更重要。131富含脯氨酸的结构域(Proline-richdomains)在几个转录因子中发现几个连续的脯氨酸可以激活基因的转录。在转录因子C-Jun、AP2、Oct-2等中发现。132不同的激活结构域有不同的激活对象

如酸性激活结构域可以从下游的增强子位点处激活转录，但是proline-rich结构域只有微弱的活性，glu-rich结构域则没有活性。pro-rich结构域只在酵母中有活性，glu-rich结构域没有活性。133胰岛素对基因表达的影响是通过一系列的步骤，最终激活一种磷酸化激酶，将特殊的DNA结合蛋白磷酸化，而改变基因的表达。真核细胞转录因子活性受到磷酸化的调节这种机制被许多非类固醇类激素所采用。134如β-肾上腺激素的作用使细胞内cAMP浓度提高，cAMP作为第二信使导致一系列的基因转录开始。135cAMP升高使蛋白激酶A的一个亚基进入核内，磷酸化核内中的蛋白质—CRE结合蛋白（CREB），磷酸化后的CREB与CRE结合，靠近一些基因(这些基因就在CRE的附近)的附近，充当转录因子，打开基因的转录开关。136是一种能够提高转录效率的DNA序列，最早是在SV40病毒中发现长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍增强子(enhancer)137增强子通常长100-200bp，和启动子一样，内部可以分为若干组件，其基本核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。138(1)增强子提高同一条DNA链上基因转录效率，可以远距离起作用，通常可距离1-4kb、个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。增强子的作用有以下特点：139140141142143144(2)增强子的作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒置就不能起作用，可见增强子与启动子是不相同的。145(3)增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。146(4)增强子必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的。147最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式元件的存在。目前对这种在基因转录降低或关闭中起作用的序列研究还不多。沉默子(silencer)148已有的例子看到：与增强子的作用类似，沉默子的作用也不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用，只是作用与增强子相反。149绝缘子(Insulators)由于增强子可以远距离的起作用，如何保证它能够准确地增强一个基因的启动子而不会同时也影响附近的另外一个启动子？答案就是：绝缘子150绝缘子的长度一般为至少是42bp，位于增强子和启动子之间，或沉默子与附近基因的启动子之间，或相邻的基因之间，功能就是防止一个基因的激活或抑制作用影响到附近的其他基因。151152153154155156在可诱导的基因启动子上游序列中，还有一些信号分子的作用位点，可以对细胞内外的环境因素的变动作出反应，这些DNA序列称为“应答元件”。应答元件(responseelements)（HREs）157类固醇类激素进入细胞后先与胞内受体结合，结合了的受体复合物起到转录因子的作用，进入细胞核后在一些蛋白的帮助下结合到染色质的特定DNA序列上，增强或抑制基因的转录表达。158这些DNA序列叫做激素应答元件(hormoneresponse

elements,HREs），是比较保守的序列。正是由于具有这些激素应答元件的存在，使得激素的反应具有特异性，即激素可以特异性的激活某些基因的表达。159激素应答元件序列的保守性（雄激素）（糖皮质激素）（甲状腺激素）（维生素A酸）160典型的固醇类激素受体的结构特点具有锌指结构、转录激活区、DNA结合区、以及激素应答元件161起抑制作用的抑制因子的特点除了有激活和促进基因转录的转录因子外，在细胞中还存在有作用相反的抑制基因转录的蛋白质因子－即抑制因子存在，目前这方面的资料还比较少。162a抑制因子阻断转录因子与DNA的结合位点b抑制因子与转录因子结合，但是复合物不能再与DNA结合，从而阻断转录因子对基因转录的激活作用。c激活结构域被掩盖，但是不阻止与DNA的结合。有时抑制因子的特殊结构域可以直接抑制转录。抑制因子可能的作用机理163真核细胞抑制因子的各种功能1643.3转录后水平的调控真核细胞的基因转录完成后，要经过复杂的加工过程才能成为成熟的mRNA分子，运输到细胞质的核糖体中进行翻译。在这个过程中，有多个因素会对最后的基因产物产生影响。165√

mRNA的剪接√

选择性剪接（alternativesplicing）

√利用不同的终止密码子和加尾信号进行不同的拼接，产生不同的基因√RNA编辑（editing）常见的几种方式166选择性剪接(alternativesplicing)一个基因的转录产物在不同的发育阶段、分化细胞和生理状态下，通过不同的拼接方式，可以得到不同的mRNA和翻译产物，称为选择性剪接(alternativesplicing)。所产生的多个蛋白质称为同源体(isoform)。167选择性剪接(alternativesplicing)168选择性剪接在真核细胞中广泛存在，也说明这种调节形式的重要性。169果蝇的性分化是由一系列基因产物相互作用的结果，通过关键基因转录物的选择性剪接决定了雄性和雌性的差别。170转录后加工的调节导致同一种基因在不同组织中有不同的剪接形式，得到不同的基因产物。171α原肌球蛋白基因可得到10个不同蛋白质产物。大鼠的肌钙蛋白可产生64个蛋白质同源体。172大鼠甲状腺中的降钙素蛋白和脑下垂体中的神经肽是由同一种基因编码的，通过位置不同的加尾信号，导致成熟基因的mRNA序列的3’端不同，结果形成2种不同的蛋白。173降钙素神经肽174RNA的编辑

1986年BenneR等发现，锥虫线粒体中细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(coⅡ)基因的mRNA序列中有4个U是在该基因的DNA序列中没有的。研究后认为这些尿苷酸是在转录中或转录后插进去的。他们将这种改变RNA编码序列的方式称为RNA编辑。175基因coII的mRNA序列中有4个U不被基因DNA所编码176177BlumB等从线粒体中分离出一些长约60nt的RNA，与被编辑mRNA序列互补，可作为编辑的模板，称为指导RNA(guideRNA，gRNA)。178在mRNA合成之后运到细胞质中翻译的运输过程中也是一个复杂的过程，也存在诸多的调控点,但目前还不是很清楚。1793.4翻译水平的调控对于真核生物来说，虽然转录水平是最重要的基因表达调控点，但翻译水平也是一个非常重要的调控位点，且有的基因只能在翻译水平进行调控。1803.4.15'-UTR结构与翻译的起始调控3.4.2蛋白质因子的磷酸化与翻译的起始调节3.4.33'-UTR结构与mRNA的稳定性的调控1813.4.15'-UTR结构与翻译的起始调控5‘-UTR中含有的帽子结构、特殊的二级结构以及先导序列等均对翻译有着重要的影响。182真核mRNA基因的5’端帽子结构核类型Cappingthe5‘End

183帽子结构是否存在对翻译效率有明显的影响。帽子结构可以保护mRNA不被核酸外切酶切割降解，是保持模板稳定的重要因素；帽子结构还为mRNA向细胞质的运输提供运输信号；帽子结构为翻译起始因子所识别，并促进起始复合物的装配，提高翻译效率。5’帽子的生理功能184真核基因翻译时起始密码子的寻找是通过起始复合物在mRNA上的滑动来寻找起始AUG的，这个过程需要帽子结构的存在。185mRNA的5’端存在的二级结构会影响起始复合物的正确装配，所以会抑制蛋白质翻译的起始。在众多的起始因子中，有些就是负责清除mRNA的5’端二级结构的。还有人认为5’端的高GC含量也会妨碍蛋白质翻译的起始。186如起始因子eIF-4F的磷酸化可以提高蛋白质翻译的速度。3.4.2翻译过程中蛋白质因子磷酸化对翻译的调控蛋白质合成过程中有众多的蛋白质因子参与，这些蛋白质本身的活性还要受到磷酸化的调节。187起始因子eIF-2α被磷酸化会抑制翻译的起始eIF-2由3个亚基组成，可与携带起始氨基酸的tRNA结合，利用GTP与40S亚基结合，起始翻译过程。翻译起始结束后，eIF-2α-GTP变成无活性的eIF-2α-GDP，在eIF-2β的作用下与GTP交换，重新生成eIF-2α-GTP，起蛋白质合成起始的作用。188但如果eIF-2α被磷酸化，则就无法进行GTP与GDP的交换，导致eIF-2α无法恢复活性，会影响下一步的蛋白质的翻译起始。189细胞内eIF-2α磷酸化对翻译的调控一般表现为细胞对某种异常条件的一种应答。正常生理条件下，哺乳动物细白中存在一种eIF-2α激酶，但没有活性。当细胞受到病毒感染、干扰素诱导、高温、重金属离子等，或细胞进入M期，营养缺乏等，都会激活该激酶的活性，导致细胞蛋白质合成的停止。1903.4.33'-UTR结构与mRNA的稳定性的调控mRNA的翻译阻遏常常发生在mRNA的3’UTR区191真核细胞的基因的3’UTR包括从终止密码子到末端之间的区域，长度约1000bp。大多数基因具有3’polyA结构。192mRNA需要加上polyA之后才能运送到细胞质中。3’polyA结构对于维持mRNA的稳定性和翻译效率也具有重要作用。193有研究表明，3’端polyA的长度与该mRNA的寿命有关，翻译的次数越多，尾巴就越短；mRNA被降解之前也要先去掉尾巴。polyA结合蛋白(PABP)可以与尾巴结合，控制尾巴的长度，并防止被降解。1943’端的polyA尾巴对5’端的帽子具有保护作用。mRNA在核糖体上翻译时是呈环形结构的，其中尾巴结合蛋白与起始因子eIF-4E等的结合非常重要。如果尾巴没有或太短，尾巴结合蛋白就无法与尾巴结合，从而无法形成环状结构；polyA长度缩短会导致5’端帽子结构也开始消失。195196polyA尾巴还可以调节翻译的效率，有发现有卵细胞中的基因polyA尾巴过短没有活性，一旦受精后，这些基因的尾巴就被加长，随即开始蛋白质的合成。197研究发现3‘UTR的核苷酸序列及其结合蛋白也可以调节mRNA的稳定性。许多哺乳动物的mRNA3’UTR中含有一段富含AU的序列，称为AURE(AU-richelements),这些基因的寿命较短。可能是由于某种蛋白与AURE结合，导致与外切酶和内切酶结合，加速了mRNA的降解。198实验发现，可以通过调节polyA的长度来调节mRNA的稳定性。如组蛋白没有尾巴，如果人工加尾，会延长半衰期10倍。另外雌激素还可以调节卵黄蛋白mRNA的寿命几十倍。调节mRNA的稳定性是调节蛋白质翻译的一种手段。199在某些类型的细胞中加入调节物质可以使某种特殊蛋白质的合成增加，这可能与提高mRNA的稳定性有关，也可能与基因的转录速度提高有关，原因是多方面的。200一些蛋白直接与mRNA结合，起翻译阻遏物的作用，一般结合在mRNA的3‘端UTR区，阻止翻译的起始。许多基因受到翻译抑制的调控当细胞生长变慢时，酵母和人细胞中有一种蛋白通过干扰eIF4E和eIF4G之间的作用，从而抑制蛋白的翻译；细胞生长恢复时，该蛋白失活，蛋白质合成得以恢复。201有时细胞对某种蛋白的需求量在短时间内迅速增加，这时依靠基因转录加工再翻译就可能来不及，这类基因的表达调控就会发生在翻译水平上。此时只需将被阻遏的mRNA解除抑制，就可以迅速合成所需的蛋白质了。202这种抑制性的调控对于很长的基因(有个别基因长度达几百万碱基,如果转录再合成则需要至少1个小时!)来说尤为重要。203有些基因受到转录和翻译双重调节,则翻译水平上的是属于“细调”。在某些细胞如红细胞中，则只能进行翻译水平的调节。2043.5翻译后水平的调控真核细胞的蛋白质在合成后还要经过复杂的加工修饰过程，才能成为成熟的蛋白质分子；然后再经过正确的运输，到达目的地后才算完成蛋白质的翻译过程。这个过程也是非常复杂的。205蛋白质合成后的加工修饰方式多种多样，这里不再重复。206RNA对基因表达的调节作用第四节207以上我们介绍的基因表达调控是属于DNA与蛋白质之间的相互作用，进来研究发现，细胞内的RNA分子也同样可以对基因的表达进行调控，而且这是一种非常古老、历史悠久的而且有效的调控手段!208非编码RNA(Non-codingRNA,ncRNA)它是指除mRNA、tRNA、rRNA以外,不编码蛋白质的有功能的RNA分子。它们在细菌、真菌、哺乳动物等许多生物体的重要生命活动中发挥着极广泛的调控作用。209ncRNA在染色体的转录与失活、基因的表达与关闭、细胞周期乃至个体发育等过程中均具有重要的作用。对其进行研究,可能对揭示基因转录后调控、基因敲除、人类疾病防治及生物进化探索有重要意义。210来自基因组的所有转录产物大致可以分为两大类：编码蛋白质的mRNA和非编码RNA。许多年来基因组中大部分非编码部分被认为是基因垃圾(geneticjunk)，且通常被认为是没有功能的。211然而研究发现，这些非编码序列具有与编码蛋白质的基因同样重要的功能，它们包含其他的信息或功能。虽然人类基因组序列还没有彻底完成，但现已清楚表明编码蛋白质的序列只占到基因组全长的2％。212在其他的真核生物基因组中，我们发现生物体越复杂，不编码蛋白质的部分在基因组中所占比例越大。在酵母中大约有30％的基因组DNA不编码蛋白质，而果蝇基因组中的非编码DNA比例占到了75％。213214另一方面，一些真核生物基因组的全部序列的确定结果也很令人失望。编码蛋白质的基因数量远远低于人们当初的预想。线虫和昆虫的基因组DNA的数量只是酵母或细菌基因组的两倍，哺乳动物的基因组数量是非脊椎动物的两倍。215在哺乳动物中基因组的数目是非常保守的。人类99％编码蛋白质的基因与鼠的基因是同源的。在不同个体中编码蛋白质的基因占整个基因组比例的可变性大约在0.3％。216人的基因组中只有1％的序列是用来编码蛋白质的217因此，单独的蛋白质序列不是造成物种间和物种内所观察到的差异的原因。所以，生命形式的多样性很可能由DNA基因组中非编码蛋白质和大量的未知部分所编码。218非编码蛋白质的转录物可以分为两大类持家RNA(housekeepingRNA)调节RNA(regulatoryRNA)。219持家转录物中组成型表达的RNA种类是细胞正常功能必不可少的,包括参与初级转录物加工的所有种类RNA(snRNA、snoRNA、RNasePRNA、gRNA)，参与翻译(tRNA、rRNA)和翻译质控(tmRNA)的RNA,以及端粒酶相关RNA和SRPRNA等。220调节RNA(regulatoryRNA)或核糖核酸调节子(riboregulator)，构成了更加多样的组群，它包括真核生物和原核细胞中涉及基因表达不同方面的特异调控的转录物。在调控RNA水平能影响从转录调控到翻译控制的细胞加工过程。221调节RNA的作用机制也是多样化的，最明显的方式是RNA分子通过与mRNA的反义作用影响基因的表达。在调节RNA中还发现转录因子的调节子和RNA参与染色质结构的修饰，因而在很早期就可以影响基因的表达。222核糖核酸调节子有不同的大小，小的如microRNA，长度大约为20nt；细菌的转录后调节子，长度约100～200nt；在哺乳动物中有超过10kb的长转录物。223迄今为止，大部分的ncRNA都是在实验中获得的。除了经典的持家RNA分子外，对于在基因组序列中如何寻找定位新的ncRNA分子还没有一个明确的标准。关于ncRNA数量问题仍未确定。224现有的证据表明，在所有的生物体当中包括ncRNA在内的分子调控过程是非常普遍的。RNA如此适合这一目的的原因之一是在单细胞水平和分子系统的宏观进化上是高效的。225与蛋白质相比，RNA分子合成和降解所需的能量更少。而且RNA分子较蛋白质更不稳定也是一个优点，因为用作瞬时信号的调节分子应当快速降解。226在许多例子中核糖核酸调节子只需要与靶RNA中的互补序列通过碱基配对的方式行使功能，而蛋白质则需要更为复杂的RNA结合结构域。227调节RNA分子调节基因表达的几种机制1.一些RNA分子在染色体大片段区域的转录活化中可能起作用。遗传印迹(geneticimprinting)与ncRNA转录物密切相关。2282.一些ncRNA通过与其他RNA的反义相互作用发挥功能。细胞内源的反义RNA可分为两类：①反式反义RNA，来自推测的靶特定位点；②顺式反义RNA，反义RNA由靶RNA同一基因组区的互补链转录生成。229反义ncRNA最常见的包括microRNA和RNA干扰(siRNA)。在线虫中首次被识别的lin-4和let-7RNA可以与靶mRNA互补结合，在不影响转录物RNA稳定性的情况下阻止翻译。230通过对人类、果蝇、新杆状线虫和拟南芥的系统研究发现，microRNA代表了一大类在高等真核生物中普遍存在的反式反义RNA，在控制发育相关基因表达方面可能起着关键性的作用。231通过反义相互作用影响基因表达水平的另一种可能机制是RNA干扰(RNAi)，即通过形成RNA-RNA双链引发RNA的降解途径。在真核生物中这种RNA干扰机制是十分普遍的。2323.一些ncRNA可以影响蛋白质的活性。RNA分子可以通过结合蛋白质而影响后者的结构、酶活性及该蛋白质的配体结合活性。已有资料表明有许多ncRNA可以通过与蛋白质相互作用而调控基因表达。2334.ncRNA还参与RNA和蛋白质的亚细胞定位。在两栖动物卵母细胞中，母源mRNA在动物和植物区的正确分布是胚胎正常发育的必要条件。2345.除了一些明确知道其作用的非编码转录物之外，还有大量报道的但没有明确功能的ncRNA。一些特异性的RNA只在特异的组织或特定的发育阶段表达，它们的调节功能目前还没有研究清楚。235这里我们主要介绍2种ncRNA，它们有相同点也有不同点。siRNA与miRNA它们因为比较短小，又称小RNA2361RNA干扰、基因沉默与siRNA1.1RNA干扰的发现RNA干扰的发现纯属偶然。1995年康奈尔大学的Guo等试图用反义RNA去干扰线虫(Celegans)par-1基因的表达。237但是，除了反义RNA能诱发基因沉默，原来预期不能与mRNA发生碱基配对的正义RNA竟然同样能抑制基因表达。2381998年美国的Fire和Mello等在该领域作了深入的研究，他们将与绿色荧光蛋白(GFP)基因序列同源的dsRNA微注射到一种能转基因表达GFP的线虫中。239Fire认为，只有dsRNA才是基因沉默的根本诱导因子，在反义RNA技术中，并非反义RNA本身有高效诱发基因沉默的作用，而是在制备单链RNA过程中所污染的少量的dsRNA起了关键作用。结果发现dsRNA能高效和特异地诱发GFP基因沉默反义RNA和正义RNA均只有微弱的抑制效果240这也解释了为何在Guo等实验中发现正义RNA也能有效诱发基因沉默的原因。显然，Fire和Mello发现的这种真核生物细胞在转录后由dsRNA诱发的序列特异性的基因沉默是一种新的分子机制，该机制被命名为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)，他们也因此获得2006年诺贝尔生理学或医学奖。241RNA干扰是一种基因沉默的古老机制，它在进化中非常保守。该机制最初在线虫中被发现，后来在真菌、植物、原生动物、无脊椎动物和脊椎动物中被证明该机制同样存在。242对比：干扰素引起mRNA的非特异性降解一些长的dsRNA(一般长于26个核苷酸)能激活蛋白激酶R(PKR)／RNaseL／干扰素(IFN)途径，从而能非特异性地降解mRNA，或者整体性地抑制蛋白的翻译。243RNA干扰是由小的dsRNA(一般为21-23个核苷酸)所引发的特异性基因沉默。RNA干扰可以在细胞间扩散甚至还能遗传。研究表明，dsRNA首先被加工形成长度为21—23个核苷酸的双链RNA，该RNA就是小干扰RNA(siRNA)。244这些小的RMA分子随后由一系列蛋白复合物介导，对与之具有序列同源性的基因在转录和翻译水平上进行表达调控dsRNA导入细胞可能诱发至少四种不同的基因沉默反应，mRNA降解、转录抑制、翻译抑制和染色体重建等。245RNA干扰机制的发现推动了细胞生长发育调控的研究，并且还被用作类似于基因敲除等定向遗传学手段进行基因功能研究。RNA干扰技术在人类重大遗传性疾病和病毒性疾病治疗上有着应用前景。2461.2RNA干扰的机理RNA干扰引起的基因沉默反应大致经历四个阶段：①dsRNA的产生；②dsRNA被加工成为siRNA；③RISC装载siRNA；④RISC剪切mRNA。247第1步细胞内dsRNA的来源(5)RNA病毒基因组或病毒感染复制过程中产生的dsRNA中间产物细胞内源性dsRNA细胞外源性dsRNA(1)细胞内源性基因的双向表达(2)具有反向重复序列的细胞内源性基因表达产生的短发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)等。(3)转基因表达的mRNA为模板，通过异常聚合作用形成dsRNA(4)真核生物基因组中的转座子在复制表达过程中产生的dsRNA；(6)采用化学合成的dsRNA；或用质粒或病毒载体表达所需的dsRNA等。248第2步dsRNA被加工成为siRNA在多数情况下，dsRNA是RNAi的初始诱导因子，但是dsRNA必须被进一步加工成长度为21-23个核苷酸的siRNA才能产生RNAi反应。Dicer酶是对dsRNA切割所必需的。249Dicer酶是对dsRNA切割所必需的，属于RNaseⅢ家族中的第3类，包含2个RNaseⅢ结构域和2个dsRNA结合结构域，1个解旋酶结构域和1个PAZ结构域。Dicer酶可能以单聚体形式催化dsRNA内切反应。体外实验表明，人重组Dicer酶对dsRNA切割时，PAZ结构域绑定dsRNA的末端，dsRNA结合结构域绑定dsRNA内部，随后通过两个RNaseⅢ结构域对dsRNA的双链分别进行切割。250两个RNaseⅢ结构域对dsRNA的双链分别进行切割。dsRNA被切割成长度约22个核苷酸的siRNA片段，这些小片段是双链RNA，带有5'端磷酸基团，在其3'端有2个突出的核苷酸。Dicer酶在进化上相当保守，它在真核生物细胞中普遍存在。251第3步RISC装载siRNA被切割后形成的siRNA与一个蛋白质复合物结合。这个复合物叫做RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)，被称为RNA诱导的沉默复合物。RISC中的关键成分是具有核酸内切酶活性的Argonaut2(Ago2)蛋白。实际上Dicer酶对dsRNA的加工和随后RISC与siRNA的装配是一个耦联的过程252dsRNA结合蛋白R2D2与Dicer-2酶之间可以形成异二聚体，因此Dicer-2/R2D2异二聚体被称为RISC装载复合物(RISCloadingcomplex，RLC)。当RLC完成对dsRNA的切割后，携带着siRNA，由R2D2引导与RISC中的关键蛋白Ago2结合。253双链的