疾病诊断新方法-

疾病诊断新方法中国医科大学医学遗传学教研室金春莲DNA为基础的疾病诊断新方法

飞速进展的原因分子生物学新成就1.人类基因组计划完成.2.很多疾病基因的定位,克隆,鉴定.3.功能基因组学研究的深入分子病因搞清楚----动态突变、早现遗传、非孟德尔遗传现象等.分子生物学新技术

DNA、RNA、蛋白检测新技术1.DNA重组技术,分子杂交技术.2.PCR技术----PCR-RFLP,PCR-SSCP,PCR-DGGE.3.DNA自动测序.4.DNA芯片技术.电子计算机的广泛应用

DNA为基础的诊断领域检测基因结构（DNA），基因功能表达（RNA、蛋白质）判断是否存在基因缺陷，是分子水平的病因诊断。患者DNA诊断性检测a、不受被检材料来源的影响b、晚发性遗传病的症状前诊断成为可能c、分子水平阐明遗传异质性（基因座异质性、等位基因异质性）应用这些特征可进行产前基因诊断一、概述(1)基因检测必须要有针对目标----特定基因(2)直接检测特定基因的突变----位点、性质(3)基因示踪----连锁分析受检材料的选择：DNA，RNA或蛋白质DNA检测样品：

血液---最广泛采用的成人DNA来源漱口液或颊膜刮片---群体筛查

绒毛膜绒毛活组织---产前诊断羊膜腔穿刺取羊水---产前诊断毛发，精液---法医归档的病理学标本---肿瘤研究Guthrie卡片---新生儿筛查及样品保存取自8个细胞期胚胎的1--2个细胞---植入前诊断RNA优于DNA，但更难于获得与操作

1、目的基因易于获得组织中表达

2、较大基因未知突变筛查

3、RT-PCR和DNA测序相结合可检出DNA水平的突变，而且能可靠地检测出hn-RNA加工过程的异常剪接。RNA检测时要注意的一些问题：①避免mRNA的降解②目的基因的表达组织③许多突变导致mRNA不稳定，因此杂和个体的RT-PCR产物可能只显示正常等位基因。

蛋白质表达分析---检测特异蛋白质

免疫印迹（Westernblot）

免疫组织化学

免疫荧光技术蛋白质截断试验（proteintruncationtest,PTT）一种特异性的检测方法，用于检测移码突变、剪接位点突变或产生提前终止密码子的无义突变。蛋白质功能测定在遗传检测中发挥作用

免疫荧光技术

利用某些荧光素，如FITC、R-PE等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。二、基因检测基本原理及常用技术1.核酸分子杂交双链DNA变性

单链复性杂种DNA

加热,强酸,探针

强碱,变性剂探针----一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列,作为工作状态的探针必须是单链.常用探针种类----基因组DNA,cDNA,人工合成的寡核苷酸.探针标记放射性同位素标记法-----缺口平移法,末端标记法,随机引物标记法.非放射性标记法-----地高辛标记,生物素标记,辣根过氧化物酶标记等.(1)斑点杂交(Dotblottinghybridization)

主要应用于基因缺失,和拷贝数改变

ASO探针----检测已知点突变.(2)Southern印迹杂交1975年EdwardSouthern建立的检测DNA技术.基因组DNA限制酶消化凝胶电泳分离变性转移到硝酸纤维素膜(尼龙膜)固定预杂交探针

杂交洗膜放射自显影分析杂交片段的大小及密度.能推测:1.DNA片段的缺失,插入,重排等.2.改变限制酶酶切位点的点突变.3.DNA扩增等拷贝数改变.4.RFLP等多态性.NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP随机引物标记探针5`3`5`5`3`DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bpprimerKlenow,dNTP变性-复姓SouthernBlotDNA

样品

应用：1）混合样品DNA鉴定2）基因缺失检测3）基因表达分析

点样Probe-32P检测AB1234(3)Northern印迹杂交

检测RNA的分子杂交技术提取组织总RNAoligodTmRNA含甲醛

的琼脂糖凝胶电泳分离转移预杂交探针杂交洗膜放射自显影

检测特异mRNA大小和表达量.(4)原位杂交及荧光原位杂交(Flurescenceinsituhybridization,FISH)

染色体标本上,组织切片上分子杂交NortherBlot原位杂交----3H标记探针FISH-----荧光素或生物素标记应用于基因定位，染色体数目及结构异常诊断。组织切片上的FISH----mRNA水平表达及一些病原体感染诊断。2.PCR技术（Polymerasechainreaction)1985年美国cetus公司的KaryMullis创建，80年代一向革命性技术，1993年获诺贝尔化学奖。模拟生物体内的DNA复制，在体外DNA聚合酶酶促合成某一特异DNA片断的技术。步骤：

变性

20----30周期复性延伸引物的核苷酸顺序将决定扩增片断特异性及其长度，该技术灵敏度高，特异性强，操作简便，快捷，目前自动化操作。（1）PCR----RFLP（2）PCR----SSCP(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)

(3)PCR----DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis）（4）PCR---DHPLC

PCRPCR扩增三、筛查致病基因突变筛查致病基因的缺陷----点突变、缺失、重复、重排及动态突变等。受诸多因素的限制，仅限于

遗传方式已知，

致病基因或cDNA已被克隆分离，致病基因的突变性质与疾病关系已被阐明等前提下。未知点突变检测缺失（重复）检测PCR----SSCP

1、多重PCRPCR----DGGE2、MAPHPCR----DHPLC3、MLPA4.Sequencing5.DNA芯片技术

（1）PCR-SSCP原理：PCR扩增后的DNA片段经变性成单链，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率。相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，可产生不同的构象，造成泳动变位。能检测已知和未知的碱基置换。长度相同，但只要一个碱基的差别→形成不同构象→泳动速率不同→形成不同泳动带PCR-SSCP过程：

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP掺入

PCR扩增产物

↓

变性↓

单链DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓12345

自显影↓1.为正常结果分析2、4、5纯合患者

3.为杂合子

.

PCR-SSCP过程

关键是电泳条件----凝胶的温度,离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等相关.该方法灵敏度高,但存在假阴性,检出率约有80%.（3）PCR-DGGE原理：利用DNA片段的溶解性质，使同源和异源双链分离的电泳系统。PCR扩增后的DNA片段在变性梯度由低到高的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，使正常和突变的同源和异源双链DNA产生泳动变位，使其分离。能检测未知的碱基置换。垂直DGGE结果

图3确定变性剂浓度范围20%-80%6%DGGE检测家系成员PAH基因外显子6的电泳图：Ⅱ1Ⅰ1Ⅰ2Ⅱ2

ⅠⅡ121N？(3)PCR-DHPLC也称WAVE核苷酸片段分析系统。原理：利用高效液相色谱原理，通过一个DNA分离柱----DNASep柱进行核苷酸片段的分离和分析。DNASep柱分离：

①在非变性条件下（50oC）DNA双链按长度分离。

②部分变性条件下（95oC变性后逐渐冷却到一定温度）杂合双链和纯合双链（有突变时）能分离。③完全变性条件下，DNA双链解开，二级结构消失，DNA或RNA单链按碱基顺序分离。DNA部分变性条件下检测DNA变异的原理：

变异型和野生型DNA可形成同源和异源双链．其在色谱柱上保留时间存在差异，异源双链因存在错配区而更易变性，在色谱柱保留时间短于同源双链而先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线，据此可以分辨出变异型DNA.在经历95℃变性再缓慢复性后,存在多态或突变位点的靶序列PCR产物会杂交形成杂合双链(heteroduplex)和纯合双链(homoduplex)混合物

DHPLC的特点：灵敏，准确；分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分钟；容易实现自动化操作；适用于较大样本中基因突变的筛查检测变异的PCR产物长度范围最好在200～500bpDHPLC可应用于：①DNA片段已知和未知点突变的检测及突变筛查。②RFLP，STRs，SNP等多态的研究及基因型分析。③甲基化分析。④基因表达的定量及基因表达差异分析。⑤寡核苷酸的分析及纯化。（4）DNA测序Sanger法-----双脱氧核苷酸末端终止法。P-OH2C不能形成5’磷酸和

5’碱基3’OH之间的磷酸

4’1’二脂键（因3’也脱

3’2’氧）而终止反应。

HH4个反应体系分别加入ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP，将产生不同长度（在A，G，C，T处随机终止）的DNA片段，分别在变性凝胶电泳分离呈梯状带型，自下而上是5’3’被合成的DNA链顺序。DNA自动测序应用如上原理，不同的是①4种不同荧光染料标记的dNTP掺入酶促反应(不用分4个反应体系).②经过毛细管凝胶电泳分离(不用分4个泳道).③激光分析和计算机处理,直接标出碱基序列.（5）DNA芯片技术在杂交和测序的基础上发展起来的.①.大规模集成电路手段把成千上万个寡核苷酸探针有规律地排列在指甲大小的芯片上----制作寡核苷酸阵列.②.将待测的DNA,RNA或cDNA用荧光标记后在DNA芯片上与探针杂交.③.用激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描,配合计算机处理荧光信号,得出所需信息.

基因芯片如：

靶基因

基因组

特异性片段探

针

----AGCTTAGC----靶序列

----TCGAATCG----probe

ABC

12345检测检测缺失和重复⑴多重PCR（multiplexPCR）一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个特异的PCR产物。常用来检测同一基因的多个外显子的缺失突变，或作为PCR扩增内对照。

⑵多重可扩增探针杂交(MAPH)

MAPH(multiplexamplifiablprobehybridization)

是近年来发展起来的一种用于基因组中DNA拷贝数检测的新技术。

该方法根据所检测的DNA序列,制备若干具有通用引物的PCR产物作为可扩增探针组,与固定在尼龙膜上待测的基因组DNA杂交。用磁珠回收特异性杂交的探针,通用引物扩增后,凝胶电泳分析。多重可扩增探针杂交(multiplexamplifiablprobehybridization,MAPH)的原理

(3)多重连接探针扩增（muotiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)的原理MLPA是基于MAPH技术基础上发展起来的，是一种灵敏度很高的相对定量技术，利用简单的杂和（hybridization）、连接（ligation）及PCR扩增（PCRamplication）反应，在单一反应管内同时检测最多40个不同片断的拷贝数的变化。MLPA的原理

MLPA和MAPH技术的应用:

遗传疾病基因缺失、重复(如SMA、DMD基因等)、基因甲基化检测(如Prader-Willisyndrome(PWS)andAngelmansyndrome(AS))、抑癌基因诊断(如Breastcancer、Lungcancer…等)及mRNA分析等。如染色体数目异常(Trisomy13、18&21)、

至今已发展出的检测探针种类，已超过上百种。

141为正常对照，881患儿外显子2重复134患儿外显子51，52，53，54缺失，135为患者母亲，为外显子51，52，53，54缺失携带者，137为正常女性对照，140为正常男性对照。四、检测特定序列变化----已知突变检测适用于：a检测特定基因中常出现的突变

b检测家系内已确定的突变已知点突变检测

技术

1.限制性内切酶酶切图谱分析法.2.ASO探针杂交法.3.等位特异性PCR.4.PCR-SSCP.PCR-DGGE

、PCR-DHPLC5.Sequencing

DNA芯片技术

(1)限制性酶切图谱分析法---检测已知突变基因较大片段缺失或插入酶切片段长度改变.基因点突变正好发生在某限制酶识别位点酶切点消失或增加酶切片段长度改变.例1.β地贫-----β珠蛋白部分缺失缺第2内含子部分和第3外显子以及3’端非翻译序列的部分缺失.

A(正常)pstIpstI4.4kbE1I1E2I2E35’3’

B(ßO—地贫)5’3’3.7kbpstIpstI

AB4.4kb3.7kbGenomicDNApstI

消化电泳分离southern转移以ß珠蛋白为探针检测结果

A(正常)-----4.4kb杂交带

B(异常)------3.7kb杂交带(缺失0.7kb)例2HbSβ链第6位AAGATGTT(AT)(Glu)(Vol)

结果MstI切点消失正常

5’3’MstI

βAβAβS1.15KbβS

1.35kb1.35kb1.15kb

GenomicDNA经MstI酶解后

β珠蛋白基因为探针Southern印迹杂交结果

:βAβA----1.15kb,0.2kb

βAβS----1.35kb,1.15kb,0.2kb

βSβS----1.35kb酶切图谱法检测的缺点:①.不直接影响酶切点的突变不能检测到.②.产生的片段大小太相似也不易被检测到.目前还可以特异性扩增含酶切位点的PCR扩增片段,再经酶切后电泳检测----更简便,快速,也能弥补缺点2.(2)ASO探针杂交法---检测已知点突变ASO探针(allelespecificoligonucleotideprobe,等位特异性寡核苷酸探针)以点突变为中心合成20bp左右的一对探针与正常序列杂交与异常序列杂交的一对探针例如:α—抗胰蛋白酶缺乏症

ASO探针

正常:5’ACCATCGACGAGAAAGGGA3’异常:5’ACCATCGACAAGAAAGGGA3’斑点杂交结果:NNNAAA

ab优点:

1.这种探针可准确合成.2.摆脱了对限制酶的依赖性,即不改变酶切位点的突变也能检测.

缺点:

突变位点及性质清楚的前提下才能合成ASO探针,只能检测已知点突变.(3)等位基因特异性PCR扩增

进行配对PCR反应，一个引物在两个反应体系中相同（通用引物），另一个引物在两个反应体系中稍有不同。一个是正常序列特异引物，另一个是突变序列特异引物（即引物3’末端最后一个碱基不同）。（4）三核苷酸重复疾病的遗传检测Hantington病、强直性肌营养不良、脆性X染色体等三核苷酸重复扩展引起的疾病要应用PCR扩增和Southern分子杂交相结合的方法。五、基因示踪前提条件：a明确的临床诊断

b致病基因已被定位

c有可选择的遗传标记所谓基因示踪是以DNA多态为遗传标记，进行连锁分析，判断是否得到了带有缺陷基因的染色体而做出诊断。DNA多态的概念及类型DNA多态性(DNApolymorphism):

群体当中不同染色体上的基因每几百个bp中大约有1个的比例存在碱基取代,但对表现型无改变,这种变异的频率在群体中占1%以上,这种现象叫DNA多态性,这种变异以孟德尔共显性遗传方式传递。1.RFLP(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,限制性片段长度多态性)第一代遗传标记.

由于DNA多态性,取代的碱基正好位于某一限制酶切割识别顺序,那么不同个体,不同染色体上的DNA用相同酶切割时产生不同长度的DNA片段,这种现象叫RFLP.等位片段数一般是2—3个,即有酶切点和无酶切点.2.VNTR(Variablenumbertandemrepeat,数目可变的串联重复)----第二代遗传标记.大约几十bp长的碱基顺序在人群中不同染色体上其重复的拷贝数不同所产生的多态,一般在非编码领域中.

小卫星DNA(6---20bp)n

微卫星DNA(2---6bp)n也称STR(smalltandemrepeat)例如:FⅧgeneST14(DXS52)位点,存在(60bp)n的VNTR.

DMDgeneintron44,45,49,50中存在(CA)n多态.PAHgeneintron3中STR(4bp)n.优点:群体中等位基因数目多,杂合子率高---更有意义（可提供信息量高）.PCR-VNTR检测PCR-VNTR3.SNPs(singlenucleotidepolymorphism,单核苷酸多态)---第三代遗传标记.基因组中广泛存在的碱基置换,大约几百---1kb之中有一个的比例.连锁分析举例PAHgeneMspI/RFLP23kb19kbMspIMspI19kb23kb基因示踪的优点:不一定清楚病因基因的分子基础,只要有基因内或近旁DNA多态标记就可以分析.缺点:1.必须要有先证者以及家系中相关各成员的DNA才能分析.2.携带者是多态位点的杂合子时才能分析.3.连锁分析要充分认识到由于减数分裂时同源染色体交叉互换导致误诊的可能性.六、基因检测的应用（1）遗传病-----产前基因诊断.

1）假肥大性肌营养不良症是一种严重的神经肌肉疾病分为DMD

(Duchennemusculardystrophy杜氏肌营养不良症）

和BMD(Beckermusculardystrophy)，肌萎缩当中占60%.均是由于dystrophin基因突变所致的致死性神经肌肉性遗传病，发病率为1/3500,XR遗传.BMD比DMD发病晚,病情轻.

主要症状:通常3---5岁发病,开始走路不稳,鸭型步态,上楼梯困难,Gower征阳性.进行性肌萎缩伴有腓肠肌假性肥大,10多岁下肢瘫,一般在20多岁之前死于心衰或呼吸衰竭.生化检测:血清中磷酸肌酸激酶(CPK)升高.乳酸脱氢酶升高（LDH）,肌红蛋白（Mb）升高。肌电图:肌源性改变等.1987年Kunkel等定位克隆DMD基因,定位于Xp21,全长2400kb,含79个外显子,cDNA长度为14kb.目前研究已知DMD的55%---65%是由于DMD基因不同区段的缺失,缺失发生热点区DMD基因5’端外显子(2----19)

外显子44---52区域，基因重复占5%～10%,点突变占25%左右。其中基因缺失为主要突变类型。

Dystrophin基因及蛋白

直接检测基因突变:检测DMD基因缺失（重复）突变

①应用多重PCR(multiplexPCR)检测缺失,18对引物(9*2)-----98%缺失能检测到.

②多重连接探针扩增（muotiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)

检测DMD基因点突变

应用

PCR----DHPLCPCR----SSCPPCR----DGGESequencing等技术多重PCR检测缺失Duchenne/Becker型肌营养不良(DMD/BMD)方法:根据dystrophin基因缺失的分布设计12对引物,分成3组第1组:为外显子19、43、45、34引物第2组：为外显子51、12、50、53引物第3组：为外显子48、17、8、52引物分别对患者基因组DNA进行扩增，每次扩增均同时设正常对照。1:DL2000marker;2:正常对照(第1组引物);3.4:检出外显子19的先证者和胎儿:5:正常对照(第2组引物);6.7:检出外显子51的先证者和胎儿;8:正常对照(第3组引物);9.10:检出外显子48的先证者和胎儿.134患儿外显子51，52，53，54缺失，135为患者母亲，为外显子51，52，53，54缺失携带者，137为正常女性对照，140为正常男性对照。多重连接探针扩增(MLPA)检测Dystrophin基因第47外显子DHPLC检测结果左侧为无关个体第47外显子的正常峰形右侧为DMD患者13号样本第47外显子的突变峰形。

基因示踪---连锁分析

RFLP连锁分析