蛋白质总量的测定

一、半微量凯氏定氮法（水蒸气蒸馏法）1、 原理样品与硫酸一同加热消化，含氮有机物即分解产生氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵留在溶液中。在定氮仪中，加入强碱碱化，是硫酸铵分解出氨，借水蒸气将氨蒸至硼酸溶液中，生成四硼酸铵，用标准盐酸滴定，即可求得样品中总氮量，并换算出蛋白质含量。消化：有机物+HSO-CO,f+SOf+HOf+NHf2NH+HSO—（NH\SO,TOC\o"1-5"\h\z2 4 、 4,2 4蒸馏：（NH）cSO+2NaOH—2HO+NaSO+2NHf42 4 2 2 4 3吸收：2NH3+4H3BO3—（NH4）2B4O7+5H2O滴定：（NH.）OBO+2HC1+HO—2NHC1+4HBO.247 2 4 3 32、 试剂（1） 浓硫酸-过氧化氢-水混合液（2+3+1）在100mL水中缓缓加入浓硫酸200mL，冷却后再加入30%过氧化氢300mL，混合备用。此液放阴凉处可保存一个月。（2） 混合指示剂贮备液取50mL1g/L漠甲酚绿无水乙醇溶液与200mL1g/L甲基红无水乙醇溶液混合，贮与棕色屏中备用。（3） 硼酸-指示剂混合液取100mL20g/L硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈紫红色即可（约加1mL指示剂）。（4）混合催化剂硫酸铜（CuSO4・5H2O）10g，硫酸钾100g硒粉0.2g，在研体中研细，使通过40目筛，混匀后备用。（5） 0.01mol/LHCl标准溶液。（6） 400g/LNaOH溶液。3、 测定步骤消化：准确称取试样0.2〜0.3g置入100mL凯氏烧瓶中，加混合催化剂1g，同时加硫酸-过氧化氢-水混合液3〜5mL，稍加振摇，置于电炉上，在通风橱内加热进行消化。开始时用低温加热，勿使瓶中泡沫超过屏肚的三分之二，待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度保持微沸。消化到溶液呈浅蓝绿色的透明状时，再继续加热沸腾10min，取出，冷却至室温后，将消化液转入100mL容量瓶中，用70〜80mL水洗涤凯氏烧瓶，冷却至室温后加水稀释至刻度，摇匀。同时作一空白，除不加试样外，其他操作相同。蒸馏：在半微量凯氏定氮仪的蒸馏瓶中，加入5mL稀释消化液和10mL水，再加入10mL400g/LNaOH溶液，立即用水蒸汽蒸馏，接受三角瓶中加20mL硼酸-指示剂混合液。待蒸馏瓶沸腾后蒸馏5min。滴定：用0.01mo1/LHC1标准溶液滴定三角瓶中的吸收液，滴定至溶液有绿色变成浅紫红色为止。吸收5mL空白消化液，按照上述操作步骤进行操作。4、 计算粗蛋白含量（干基，%）=（V礼）XcX0.0140XKX—X100X^^0 m1X式中V——滴定试样时消耗HC1标准溶液的体积（mL）V0——滴定空白时消耗HC1标准溶液的体积（mL）C——HC1标准溶液的浓度（mo1/L）K一氮换算成粗蛋白的系数，一般取6.25；m 称取试样质量（g）；X 试样水分含量（%）0.0140——消耗1mL1mo1/HC1标准溶液相当于氮的质量（g）二、双缩脲比色法原理蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2形成紫红色络合物，在540nm处有最大吸收。其颜色深浅与蛋白质成正比，而与蛋白质的相对分子质量及与氨基酸成分无关。该法测定范围为1〜10mg蛋白质，适用于测定精度要求不高的样品。试剂（1）双缩脲试剂在500mL容量瓶中，依次加入40g/L硫酸铜溶液30mL和25g/L酒石酸钾钠溶液100mL，再慢慢加入5mol/LKOH溶液30mL，最后用水稀释至刻度。（2）酪蛋白标准溶液再用0.05mol/LNaOH溶液配制成20mg/mL的酪蛋白标准溶液。操作步骤绘制标准曲线：取6支试管，分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL酪蛋白标准溶液，并分别补水至ImL。个加入10mL双缩脲试剂，摇匀，在60。。恒温水浴中显色5min，于550nm波长下，以0号管为空白，测定吸光度。以蛋白质质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。样品处理与测定：准确称取固体样品0.10000g，放入干燥的试管中，内放几颗玻璃珠，加上1mL水和10mL双缩脲试剂，在60°C恒温水浴振荡器上振荡5min，随后以4000r/min离心10min。取上清液于550nm波长处以试剂空白为对照测定吸光度。从标准曲线上查出相应的蛋白质质量（mg）。液体试样：取1mL试液，加10mL双缩脲试剂，直接显色测定。计算蛋白质含量（%）=m'X X—X1001000m式中m‘一一由标准曲线查得酪蛋白的质量（mg）1000 mg换算成gm——试样称取质量（g）紫外吸收法原理：蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在波长280nm处具有最大吸收峰。由于各种蛋白质都含有酪氨酸，因此280nm处的光吸收是一种普遍的性质。在一定程度上，蛋白质溶液在280nm处的吸光度与其浓度成正比，故可用作蛋白质定量测定。核酸在紫外线区也有强吸收，可通过校正加以消除。试剂：(1)60%碱性乙醇溶液称取NaOH2g，溶于少量60%乙醇溶液中，然后用60%乙醇溶液稀释至1000mL。(2)300g/LNaOH溶液测定步骤准确称取粉碎并过40目筛的样品0.5g，置于研钵中，加少量石英砂和300g/LNaOH溶液2.0mL，研磨2min。再加60%碱性乙醇溶液3mL，研磨5min。然后用60%碱性乙醇溶液将研磨好的样品洗入25mL容量瓶中，定容。摇匀后静止片刻，取部分浸提液离心10min(3500r/min)。吸取上清液1mL于25mL容量瓶中，用60%碱性乙醇溶液稀释并定容，摇匀。同样，按以上操作做试剂空白试验。于280nm和260nm波长，用1cm比色皿，以试剂空白为对照分别测定样品的吸光度。计算