周四文献翻译

parkin蛋白和USP30经泛素化过程协同调控线粒体自噬ChristianN.Cunningham,JoshuaM.Baughman,LilianPhu,JoyS.Tea,ChristineYu,MaryCoons,DonaldS.Kirkpatrick,BarisBingolandJacobE.Corn翻译者：刘梦玲学号：方法发现，USP30过度表达，线粒体蛋白质偏向于去泛素化，在质谱分析中还USP30的异常表达足以阻止细胞器的自噬，的数据揭示了parkin蛋白和USP30对线粒体上的Lys6-和Lys11-相关信号的调控机制，并指出了parkin蛋白介导的线粒体自噬过程中的非典型链型。线粒体膜去极化使parkin蛋白将Lys6和Lys11链添加到线粒体膜上蛋白的细胞经CCCP处理后，细胞内Lys6连接的多聚泛素肽高度富集，这也成为图1：Ls6Ub链富集于CCCP处理的HEK293和SH-SY5Y全细胞裂解液及线粒体中(a)HEK293细胞中免疫亲和纯化肽的离子色谱图（HEK293细胞经CCCO处理（5μM，2小时）或过表达parkin蛋白）；(b)CCCP处理后HEK293细胞中的Ub连接丰度；(c)SH-SY5Y细胞中免疫亲和纯化肽Ub连接丰度（CCCP处理(10μM,2)后GFP–parkin蛋白过表达；(d)线粒体损伤后其泛素链型及细胞质泛素化蛋白丰度。为了确定全细胞溶解物中Lys6链的增加是否优先发生于线粒体，用将CCCP或DMSO处理的稳定表达GFP–parkinHEK293细胞分为胞浆和富含线粒Lys63，Lys11，Lys6链含量高度增加，但在胞浆部分的没有明显含量变化（1d）CCCP处理和未经处理的样品中同时出CCCP40–70kDa70–100kDa范围片段出现了最大程度的增加（1c，D）CCCPSH-SY5YLys6链parkinLys6连接的多聚泛素链（补充2）。USP30由于UP30是一种对parkin链去泛素化的特异性是否反映了parkin（残基；以下简称UP3（螺旋和线粒体外膜的定位信号的重组UP30UP30USP7及UP2催化结构域逐渐形成的同时-AMAMC为7-氨基-4甲基香豆素（图），反应进程通过荧光监控。由于UP3和UP7表观m值高于-AMVma此对于由Lineweaver-urk分析的斜率得到的Kcat/K的解释具有限制性。测量得到的Kcat/比值均与以前的报道相一致，即为UP7（5.3103−1−1）和（6.5105M−1s−1；参22、23），并得到USP30的KcatKm为1.3×104M−1图2：USP30是一种倾向于紧凑Ub链型的特异性去泛素化连接酶。(a)通过测量不同浓度时反应初始速率，用Lineweaver–Burk分析USP30,USP7andUSP2的催化结构域；(b)USP30对AMC的泛素化和类泛素化的影响；(c)二聚泛素裂解结果；(d)四聚泛素裂解法结果；(e)二聚物剩余量定量分析；(f)四聚物剩余Lys48的二聚体却具有很强的去泛素化活性（图2e）。我们注意到，这种三链类型的晶体结构都彼此不同，但与抗USP30性，但USP依然更多地与Lys6，Lys11、Lys48更长的B链的亲和力效应在其识别和加工过程中发挥作用。因此，通过逐一与重组UP3共同培养并利用S聚丙烯酰胺凝胶电泳（S-PA）对反应进行监测的方法，我们研究了UP30对6，11，s48，63四聚体和线性多聚泛素化链的消化能力（图2D和补充图3C–F）。与Ub二聚体的结果一致，UP30（UP30裂6y11和48链的速度大于更大的（y63和线性其中s6（图UP30是一种特殊的U6泛素化连接的多聚体。USP30从完整的线粒体上移除Lys6和P30可以作用于与纯化链具有相同联锁性的线粒体锚定泛素链。事实上，我们发现了一种表达G-parkin蛋白（补充图，和表2）基因敲除细胞系HK293USP（由CRISP/Cas9（参34–36s6C处理且含UP30（图和补充图4UP30P3的作用。3：USP30优先去除完整线粒体的Lys6和Lys11(a)USP30基因敲除的HEK293细胞系和野生型细胞系的线粒体，均采用CCCP处理并进行泛素化连接分析；(b)实验装置示意图。从CCCP处理（5μM，2小时）HEK293细胞中分离出泛素化的线粒体并加入纯化的USP30进行培养；(c)不断增加与线粒体共同培养的USP30的浓度记录结果；(d使用抗泛素化抗体蛋白免疫印迹法检测线粒体的去泛素化作用；(eUSP30有一部分的链可以抵抗USP30介导的去泛素化（图3C）体（USP30usp30-c77a），我们确定了去泛素化作用需要USP30的催化活性（图3C）。从每个样品提取出50–90kDa范围的凝胶区域（补充图4E）并进行泛素化与非锚定链的结果类似，USP30Lys6，USP30介导链的去泛素化之间的平行的联锁性偏好意味着这两对USP30和parkin图4：USP30去泛素化作用于线粒体外膜底物(a)稳定表达GFP-parkin蛋白的HEK293 经C处理的细胞中，UP3过表达时，共鉴定出13个蛋白质的泛素化发生了显著变化（P＜0.05＝（图4）。CISD1，Fkbp8，GDAP1，MoS2，Mtx1，mul1，prh，tom20也被称为tomm20），trkh，VAC1，VDAC2和VAC3（lg2比<−0.8这表明它们是UP30UP30（图。parkin（图4并且当UP3浓度降低时其泛素化水平升高（图4）。我们推测这些蛋白质可能是泛素化介导的线粒体自噬的调节因子。线粒体的去泛素化作用足以对线粒体自噬进行负调控接酶中：USP2，作用于底物锚定和非锚定链的非特异性DUB；USP5，主要作用分别对两个线粒体标志物，Tom20和热休克蛋白（也称为Hspd1）进行免mtUSP5则对线粒体自噬无作用。USP5只作用于非锚定这里用到的其他的去泛素化连接酶不同，TRABID在体外对Lys29，Lys33，Lys63链有很强的链接偏好，并且它含有多种功能不甚清楚的辅助结构域。这些Lys11外，其他类型的赖氨酸泛素链也可能产生线粒体自噬信号。图5：一种典型的线粒体泛素化连接信号。(a)HeLa细胞和GFP–parkin蛋白进行免疫共转染并Flag标记线粒体定位的去泛素化连接酶（DUBs）。24小时后，用CCCP20μM,24h)处理对GFPFlag进行转染并产生HSP60和TOM20.通过TOM20和HSP60可监测线粒体自噬的抑制；(b)每个细胞正常表达的TOM20(左)orHSP60(右)强度的量化；(c)线粒体自噬信号中的特异性泛素化连接。成了精氨酸。经15hCCCP处理后，Tom20染色用于评估线粒体的降解（图5C和补充图6c）。对24hCCCP处理后的细胞也进行监测，观察到转染的野生型Ub对Lys6(K6R)或Lys11(K11R)位置突变的Ub同样明显抑制了线粒体的自噬。这意Lys6Lys1（K611R与Lys63和Lys27(K48/63R)缺陷的突变体相似，同样抑制线粒体自噬。总之，这USP30靶向作用于过氧化物酶体，可抑制过氧化物酶体的自噬为了探究UP3USP30在过Keim是一种敏感荧光蛋白，通过将过氧化物酶体定位序列与其羧基端融合得到Keim-SKim-S458nm543nm4替换UP3的MLS，使其靶向作用于过氧化物酶体。比较得到，UP30影响了HK293细胞中约50%的过氧化物酶体的自噬（图6）。这种影响取决于UP3的催化活性，因为靶向无催化活性的USP30（USP30-C77S）过氧化物酶体并没有抑制其自噬。6：异位表达的USP30能够抑制过氧化物酶体自噬。(aHEK293细胞中过氧化物酶体的ph敏感性荧光蛋白成像；(b)2天和3天时，过氧化物酶体仍位于溶酶体中的细胞数量。讨论USP30andparkin蛋白通过非典型泛素链共同调节线粒体自噬Lys48或Lys63之外的泛素化连接链）有着不同的生物学作用。我们观察到，当是发现USP30倾向于作用于结构紧凑的低聚泛素链(Lys6,Lys11andLys48),并42)和BRCA1-BARD1(refs.43–45)，而近期parkin蛋白自身也被发现可以产生Lys6和其他链型。然而，与Lys6链的组装有关的细胞功能尚不清楚。同样的，其他去泛素化连接酶能够将Lys6链去组装，例如OTUD3和USP21(ref.28