第1节重组DNA技术的基本工具

解读章首图文培养学习志向·勇担社会责任本章章引言以转基因抗虫棉产生的背景为情境引入。一方面转基因抗虫棉在我国商业化种植的历史已有20多年，产生了巨大的社会效益和经济效益，以它为素材创设情境可以激发我们的学习兴趣；另一方面我国是世界上第二个独立成功培育拥有自主知识产权的转基因抗虫棉的国家，选取这一实例有利于增强我们的民族自豪感和自信心。以此情境为依托，提出问题“为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，基因工程却可以呢？基因工程是如何进行操作的？它给我们的生产和生活带来了怎样的影响？”直接指向本章将要学习的重要内容：基因工程的基本原理、操作程序和应用。与情境相匹配，章题图选用了转基因抗虫棉棉铃和棉桃部分的特写照片，给人以强烈的视觉冲击和美的享受。章首页设计的绿色背景映衬着绿色的棉铃和枝条，寓意着基因工程焕发勃勃生机。与前两章一样，在章首页的下方是对基因工程概念的阐述。理清本章架构初识概念体系·具备系统思维第1节重组DNA技术的基本工具学有目标——课标要求必明记在平时——核心语句必背1．阐述重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。2．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3．进行DNA的粗提取与鉴定。1．DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。2．限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。3．E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。4．质粒作为基因工程的载体需具备的条件：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。[主干知识梳理]一、基因工程及其诞生与发展1．基因工程的概念2．基因工程的诞生和发展(1)基因工程的诞生①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了_________________，还证明了

。②1953年，沃森和克里克建立了_________________模型并提出了___________________的假说。③1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的

。④20世纪70年代初，多种

酶、

酶和

酶被相继发现，为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。⑤1973年，科学家证明

可以作为基因工程的载体，构建

，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。遗传物质是DNADNA可以在同种生物的不同个体之间转移DNA双螺旋结构遗传物质自我复制密码子限制DNA连接逆转录质粒重组DNA(2)基因工程的发展①1982年，第一个基因工程药物——

被批准上市。②1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出

。③1985年，穆里斯等人发明

，为获取目的基因提供了有效手段。④1990年，

计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。⑤21世纪以来，科学家发明了多种

，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。⑥2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的

技术编辑了哺乳动物基因组。重组人胰岛素世界上第一条转基因鱼PCR人类基因组高通量测序技术基因组编辑二、DNA重组技术的基本工具1．限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”(1)来源：主要来自

。(2)功能：能够识别双链DNA分子的特定

，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的

断开。(3)结果：产生

或

。2．DNA连接酶——“分子缝合针”(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的

。原核生物核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端平末端磷酸二酯键(2)种类(填表)项目E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源___________________特点只能连接_________既可以连接黏性末端，又可以连接_______大肠杆菌T4噬菌体黏性末端平末端真核细胞细胞核自我复制限制酶切割进行自我复制标记基因三、重组DNA分子的模拟操作(教材第73页“思考·讨论”)1．材料用具：剪刀代表

，透明胶条代表

。2．切割位点(1)分别从两张纸上的一条DNA链上找出___________________序列，并选_______之间作切口进行“切割”。(2)再从另一条链上

之间寻找EcoRⅠ相应的切口剪开。(3)将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。3．操作结果：若操作正确，两条链的黏性末端应能

；否则，说明操作有误。EcoRⅠDNA连接酶G—A—A—T—T—CG—A互补的碱基互补配对四、DNA的粗提取与鉴定1．实验原理(1)

不溶于酒精，某些

溶于酒精。(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于

mol/L的NaCl溶液。(3)在一定温度下，DNA遇

试剂会呈现蓝色。DNA蛋白质2二苯胺2．实验步骤[边角知识发掘]1．(教材第71页图3­3变式训练)已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为

和

，分析回答下列问题：(1)在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。(2)写出产生的末端种类：①产生的是

；②产生的是

。(3)限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的

不同，切割位点

(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有

。(4)要将限制酶SmaⅠ切割后产生的末端连接起来，需要

。黏性末端平末端碱基序列不同专一性T4

DNA连接酶2．(教材第72页图3­4拓展训练)根据大肠杆菌及质粒结构模式图完成下列问题：(1)图中A、B分别代表的物质是

、

。(2)①、②两点具有限制酶切点的是

。(3)图中氨苄青霉素抗性基因可作为

。拟核DNA质粒①标记基因[教材问题提示]一、旁栏思考题1．(教材第71页)原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。2．(教材第72页)DNA连接酶和DNA聚合酶不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E.coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到的，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯键(在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基因的羟基之间形成)，那么，二者的差别主要表现如下：(1)DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是催化单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶以一条DNA链为模板链，催化形成与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，它不需要模板。此外，两者虽然都是蛋白质，但它们的组成和性质各不相同。二、思考·讨论(教材第73页)1．剪刀代表EcoRⅠ；透明胶条代表DNA连接酶。2．根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。3．插入的DNA片段不能称得上一个基因，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。2．限制酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？提示：限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.coliDNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。[师说重难]

一、基因工程的工具酶1．限制性内切核酸酶(1)作用特点：具有专一性。表现在以下两个方面：①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。②能够切割特定序列中的特定位点。(2)识别序列的特点特点遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如右图实例如

以中心线为轴，两侧碱基反向互补对称

以为轴，两侧碱基反向互补对称(3)作用产物：黏性末端或平末端。黏性末端特点是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的图示平末端特点是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的图示2．限制性内切核酸酶与DNA连接酶的关系(1)区别(2)关系图解名称作用应用限制性内切核酸酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接二、DNA连接酶与DNA聚合酶的比较比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成不同点是否需要模板不需要需要接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键作用结果将已存在的DNA片段连接合成新的DNA分子用途基因工程DNA复制[在应用中悟][典例1]限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示，下列有关说法正确的是 (

)A．一个DNA分子中，酶a与酶b的识别序列可能有多个B．酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接C．酶a与酶b切断的化学键不完全相同D．用酶a切割有3个识别位点的质粒，得到4种切割产物[解析]

一个DNA分子中，可能存在一个至多个酶a与酶b的识别序列，A正确；由图可知，酶a与酶b识别的序列虽然不同，但切出的黏性末端相同，相同的黏性末端能相互连接，B错误；酶a与酶b切断的化学键均为相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；质粒为小型环状DNA分子，用酶a切割有3个识别位点的质粒，可得到3种切割产物，D错误。[答案]

A[典例2]下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是 (

)A．T4DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来B．E.coliDNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸[解析]

DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来，C正确，D错误。E.coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接，B错误。T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，A错误。[答案]

C[在训练中评]1．下列有关基因工程的叙述，正确的是

(

)A．限制酶只在获取目的基因时才用B．重组质粒的形成是在细胞内完成的C．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点D．DNA连接酶和DNA聚合酶都连接磷酸二酯键解析：限制酶的作用是识别特定核苷酸序列，并在特定的位点切割DNA片段，包括切割目的基因和载体，A错误；重组质粒是在细胞外用DNA连接酶形成的，B错误；并不是所有的质粒都能作为载体，所以也不是在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点，C错误；DNA连接酶和DNA聚合酶都能使两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键，D正确。答案：D

2．如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是 (

)A．DNA连接酶、限制酶、解旋酶B．限制酶、解旋酶、DNA连接酶C．解旋酶、限制酶、DNA连接酶D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶解析：由图示分析可知，①处为氢键，是解旋酶的作用部位；②处为磷酸二酯键，是限制酶的作用部位；③处为两个DNA片段的缺口，是DNA连接酶的作用部位。答案：C

2．基因工程用作载体的质粒常有特殊的标记基因，请举例说明其作用。提示：标记基因如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，其作用是便于重组DNA分子的筛选。3．DNA粗提取与鉴定实验中，选用不同的实验材料采取的方法可能有所不同，这是为什么？本实验提取的DNA可能含有哪些杂质？提示：一般植物材料需要充分研磨，但有些动物组织只需要制成匀浆(如猪肝等)，然后加蒸馏水使其吸水涨破，即可释放出细胞内的DNA；若以鸡血细胞为实验材料直接加蒸馏水即可。所以不同的实验材料可能采用的方法不同。可能含有核蛋白、多糖等杂质。说明：一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。3．基因工程载体的作用(1)用它作为运输工具，将目的基因送入受体细胞中。(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制并表达。二、DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项1．因为玻璃棒有吸附DNA的作用，浓缩后的DNA丝状物可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起。如果DNA丝状物较少，不易吸附在玻璃棒上，也可以用筷子等表面粗糙的用具来帮助DNA分子缠绕。2．粗提取的DNA丝状物要用滤纸吸去上面的水分或离心得到的沉淀物要晾干，然后再溶解在2mol/L的NaCl溶液中进行鉴定。3．DNA的溶解度与NaCl溶液浓度有关。实验中鉴定DNA通常用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA，需要不断搅拌以增加DNA的溶解量，通常要3min以上。4．加入预冷酒精后，要用玻璃棒缓慢、轻轻的沿一个方向搅拌溶液，玻璃棒不能插入到烧杯底部。5．二苯胺试剂一般要现用现配，以保证实验效果。6．鉴定DNA的其他方法。①紫外灯照射法：用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙锭(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色丝状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰在260nm处)。②电泳法：此方法适合鉴定纯度较高的DNA。[在应用中悟][典例1]作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是 (

)A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的筛选[解析]作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA分子的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。[答案]

A[典例2]下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是 (

)A．向洋葱组织中加入蒸馏水并搅拌可释放核DNAB．实验中的过滤是为了得到纱布上的DNAC．向DNA滤液中加入冷酒精缓慢搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物D．可以选用不同的实验材料但提取DNA的方法是相同的[解析]洋葱细胞为植物细胞，有细胞壁保护，因此加蒸馏水不会释放核DNA，A错误；过滤洋葱研磨液，目的是为了获得含有核物质的滤液；B错误；DNA不溶于酒精，因此向DNA滤液中加入冷酒精缓慢搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物，C正确；选择的实验材料不同，提取DNA的方法会有所不同，D错误。[答案]

C[在训练中评]1．下列关于质粒的叙述，正确的是 (

)A．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B．质粒是细菌细胞质中能够自主复制的小型环状DNA分子C．细菌质粒和真核细胞DNA的基本结构单位不同D．细菌质粒的复制过程一定是在细胞外独立进行的解析：质粒广泛存在于细菌细胞中，是细菌细胞质中能够自主复制的小型环状DNA分子，不是细胞器，A错误，B正确；细菌质粒是环状DNA分子，和真核细胞DNA的基本结构单位相同，均为脱氧核苷酸，C错误；有的质粒可以整合到宿主细胞的染色体DNA上，伴随宿主细胞一起复制，D错误。答案：B

2．(2021·山东高考)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是

(

)A．加入适量的木瓜蛋白酶B．37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟C．加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精D．加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14mol/L解析：木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60～75℃的水浴箱中保温10～15分钟，使蛋白质变性析出，B错误；向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会