大豆根际土壤中氢氧化细菌的分离及特性研究

大豆根际土壤中氢氧化细菌的分离及特性研究

1大豆根瘤的诱导诱导因子作物的轮作和间作，尤其是豆科作物的轮作和间作，可以提高土壤肥力，减少肥料需求，提高作物产量。这是防止土壤侵蚀、长期保持土壤肥力的一般农业措施。豆科作物和大豆的轮作和间作效应主要被认为是大豆根的残余氮的作用。根据最近的研究，氮不能完全取代豆科作物的轮作效果，大约75%的生产效果无法用现有理论来解释。豆科植物根瘤菌在固氮过程中可能会产生b2，每固定的氮分子只有大约1.5个氢分子。这些根瘤菌可以通过转化酶（hup）氧化生成氨氮，并回收b2的能量。这些根瘤菌的根瘤，如羟基磷酸酶（hup）引起的氧化，因为它们中的氢氧化酶（h），因此被称为hyp。虽然这些根瘤中不含有氢氧化酶，但它们含有氢氧化酶。例如，hup-大豆类动物不能氧化生成b2，因此根瘤周围土壤中的b2含量很高。董仲民等人认为，这些诱导植物生长的根瘤可以促进根之间的微生物生长，进一步促进植物生长，即所谓的“氢肥理论”。这些诱导植物生长的根瘤微生物是氢氧化细菌。由于氢氧化细菌的独特特征和大多数土壤细菌的不可培养性,土壤氢氧化细菌的分离极其困难,有关氢氧化细菌的研究报道较少.本文采用气体循环培养体系(持续通氢气装置),以H2作为唯一能源分离大豆根际土壤中的氢氧化细菌,并对分离筛选菌株的基本特征进行了测定.2材料和方法2.1hup-大豆种植间的土壤的采集2005年10月在陕西关中地区的三原县、铜川市郊的HUP-大豆植株的大田,选取生长6周以上、长势旺盛、长有大量根瘤的HUP-大豆植株,采集距离根瘤5mm以内的大豆根际土壤.2.2学习方法2.2.1木纳组合so3采用矿质盐培养基(MSA):NaNO32.0g;K2HPO41.2g;MgSO40.5g;KCl0.5g;KH2PO40.14g;Fe2(SO4)3·H2O0.01g;酵母膏0.02g;琼脂15g;水1L;pH7.2.2.2.2发挥吸光度和消液作用持续通H2混合气体和通空气装置如图1所示.可调节气流的压缩空气通入到2个装有300ml磷酸溶液(100mmol·L-1)的1L密闭锥形瓶中.其中一个锥形瓶的磷酸溶液中放入2个碳棒作为惰性电极,通过控制直流电的电流量来调节阴极H2的产生量,形成混合气体(H2+空气).将混合气体通入装有60ml混合土样的玻璃管后从V2排出,V1用来调节V2气流量的大小.另一个锥形瓶没有电极,不能电解水产生H2,将该锥形瓶的气体(不含H2)通入装有60ml混合土样的玻璃管后从V4排出,V3用来调节V4气流量的大小.通过一个自制的H2检测装置来检测气流量.锥形瓶中需要不定期加水以补充蒸发失掉的水分.2.2.3土壤的吸氢曲线采集的根际土壤过16目筛后,与石英砂混合(土壤∶石英砂=2∶1)防止板结.将60ml混合土壤装入两端密闭的直径2.5cm×长度60cm的玻璃管中,将5～6个玻璃管串联,通入流速为280ml·min-1,含H2量为41.6μmol·L-1的混合气体.混合土壤室温下富集培养约1个月.以不通H2的土样管作为对照.每天用气相色谱检测出气口(V1、V2)的H2含量,制作土壤的吸氢曲线.2.2.4菌落生长和纯化取富集后的混合土壤1g,稀释至10-6～10-12涂MSA平板,以减少培养基上微生物的密度,防止其他快速生长的微生物过度生长.然后在MSA上洒上灭菌土壤(每平板0.05g),以增加氢氧化细菌的生长附着面积,利于氢氧化细菌的生长.将平板放入密闭容器中,通入流速为280ml·min-1、含H2量为125μmol·L-1的混合气体,倒置培养2～4周,直至长出明显菌落.将菌落进一步纯化富集培养,直至固体培养基上的菌落和光学显微镜下观察的菌体细胞形态一致为止.将纯菌落试管放入密闭干燥器中,通入流速为280ml·min-1、含H2量为125μmol·L-1的混合气体进行培养,2周后长出明显菌苔.在纯化富集培养过程中,因干燥器中空气湿度较大,1周左右密闭容器底部和壁及培养皿外壁会有水珠凝集,需定期清除.每1周左右将试管从密闭容器中取出置于室温下,使棉塞自然干燥防止霉菌滋生,再放回继续培养.2.2.5口、分离器温度采用安捷伦气相色谱GC6890分析H2含量,1m×2mm的色谱柱内装5A分子筛,以高纯N2作载气,流速20ml·min-1;进样口温度150℃;检测器温度160℃;检测温度40℃.将长有明显菌苔的40支试管斜面改用无菌橡皮塞密闭后,用100μl进样器注入100μl纯H2,使混合气体的H2浓度在166μmol·L-1左右,充分混合后用气相色谱检测密闭试管中的初始H2含量,以1只无细菌的试管作为阴性控制.再将密闭试管在室温下水平放置于旋转摇床上培养3d,试管中的气体用100μl进样器抽出并用气相色谱检测H2含量.2.2.6细菌生长情况的观察取吸氢值大于135μmol·L-1的细菌菌株,分别稀释至10-4～10-6涂MSA平板,同时以不通氢气作为对照.将平板放入上述密闭干燥器中,通入流速为280ml·min-1、含H2量为125μmol·L-1的混合气体,倒置室温培养4周,直至长出明显菌落.对照组平板不通H2混合气体,室温倒置培养2～4周.观察两组细菌菌落的生长情况.检测细菌是否能在以H2为能源、CO2为主要碳源的无机盐培养基上的自养生长.2.2.7表1和生理生化特征的测定参照文献方法对分离筛选菌株的形态及氧化酶等19个生理生化特征进行测定.2.3处理数据采用Excel软件进行数据统计分析.3结果与分析3.1土壤残余h对土壤中豆科作物根瘤的放氢率在30～254nmolH2·cm-3·h-1,持续通氢装置产H2速率高于豆科根瘤土壤的最大放氢率,土壤氢氧化细菌可获得足够的H2供应,达到富集培养的目的.图2为土壤富集过程中残余H2浓度变化.土壤中持续稳定地通入流速为280ml·min-1、含H2量为41.6μmol·L-1的混合气体,培养初H2的消耗量非常小;在接下来的7dH2的消耗量缓慢上升,在7～12dH2的消耗量快速上升,在其后的2周时间里H2消耗量的增加速率逐渐下降,直至稳定,土壤残余H2浓度从富集培养开始时的40.8μmol·L-1降至5.4μmol·L-1,达到土壤吸氢最大值.作为对照的空气处理土样,空气中的H2浓度约为0.023μmol·L-1,通过土样后的H2浓度进一步下降,接近于0.通入H2土壤的吸氢值在第3周后达到最大值,并基本保持稳定,表明土壤中的氢氧化细菌种群数量大量增加,土壤富集培养结束.3.2初始h度值及剩余h值从平板上共分离到40株单菌落,接斜面通混合气体培养长出菌苔后,用气相色谱检测40株菌株在密闭条件下3d(72h)的吸氢值,即H2浓度减少量,以此判断菌株是否具有氧化氢能力及其能力大小.吸氢值(μmol·L-1)=密闭试管中初始H2浓度(μmol·L-1)-培养3d后密闭试管中剩余H2浓度(μmol·L-1).从表1可以看出,有22株菌的吸氢值大于125μmol·L-1,占测定菌株总数的55%;其中9株菌将试管中的H2全部耗尽,占测定菌株总数的22.5%.在通H2的MSA培养基上,2～4周内有20株菌先后长出明显菌落,菌落形态特征见表2.在不通H2的MSA培养基上,4周内均无明显菌落生长.表明这20株细菌均能利用H2为能源,以CO2为主要碳源进行无机化能自养生长.可以初步判断这20株菌均为氢氧化细菌.3.3氢氧化细菌及其生理生化特性20株氢氧化细菌菌株生理生化特征测定结果见表3.4氢氧化细菌的筛选氢氧化细菌是指能够利用H2作为电子供体,O2作为电子受体并同化CO2的一类细菌.在已有的细菌分类鉴定文献上,并没有对其进行系统归类,即它们分属于不同的属种.目前已知的氢氧化细菌分属于氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)、假单胞菌属(Pseudmonas)、副球菌属(Paracoccus)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、分支杆菌属(Mycobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、诺卡氏菌属(Nocardia)、棒杆菌属(Corynebacter)、螺旋状菌属(Spirilla)、芽孢杆菌属(Bacillus)等.氢氧化细菌能够利用H2,在于其具有活性氢化酶,或者在一定条件下能够表达或激活氢化酶基因.目前国内外有关根际促生菌(PGPR)的研究较多,氢氧化细菌作为PGPR的研究才刚起步.对氢氧化细菌的分离,一直以来都采用在密闭容器内通入80%H2、10%CO2和10%O2混合气体的配气法.这种方法存在很多局限性,且具有一定的安全隐患(H2浓度≥5%易于爆炸).与传统的配气法相比,电解水持续通氢法有较多优点:H2的制备设备简单、廉价;气体循环培养体系H2浓度较低、稳定且便于调控,无安全隐患;便于开展氢氧化细菌富集过程的持续监测;培养条件与氢氧化细菌种群的自然环境接近,便于筛选出自然条件下的氢氧化细菌.采用这种气体循环培养体系(持续通氢气装置)分离大豆根际土壤的氢氧化细菌,对氢氧化细菌研究技术体系的建立和进一步完善有重要意义.由于氢氧化细菌的独特特性、种群数量少,分离纯化培养具有较高的难度.先对土壤进行通H2富集培养,通H2量高于土壤根瘤的最大放氢量,达到模拟根际周围氢氧化细菌的最适生长环境的目的,可使其种群数量迅速增加.对HUP-豆科根瘤附近土壤的研究表明,氢氧化细菌是生长较慢的一类细菌,土壤吸氢值连续监测结果亦证实了这一结论.氢氧化细菌的筛选方法很多:1)氧化氢试验通过测试H2含量的减少,也就是氧化氢能力来检测细菌氢化酶的存在;2)通过化能自养生长试验检测氢氧化细菌以H2为唯一能源的能力;3)通过DNA杂交试验检测氢化酶基