油菜籽蛋白组成及结构研究进展

油菜籽蛋白组成及结构研究进展

油菜籽是世界上最重要的油资源，其产量仅次于大豆和棉籽。在中国、印度、欧洲、加拿大和澳大利亚是世界油菜籽的主要矿区。自20世纪80年代以来,我国油菜种植面积和油菜籽产量已稳居世界第一位;面积达700万公顷,占世界油菜播种面积26%,主要分布在长江流域及以南各地;油菜籽产量在1,100万吨以上。在现代制油技术条件下,可得到55%左右菜籽粕,全球每年菜籽粕产量约2,800万吨左右。油菜籽除含大量油脂外,还含25%~27%蛋白质,制油后菜籽粕含35%~45%蛋白质。从蛋白质氨基酸组成看,菜籽蛋白营养价值可与联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)推荐模式蛋白质媲美[2~3]。菜籽蛋白也是一种营养价值较高完全蛋白质,几乎不存在限制氨基酸。菜籽浓缩蛋白或分离蛋白与大豆蛋白一样,亦具有良好吸水性、保水性、溶解性、吸脂性、乳化性和发泡性。目前对菜籽粕食用开发研究较少,除部分菜籽粕经脱毒后作饲用蛋白源外,绝大部分尚未能充分开发利用。我国蛋白资源较为缺乏,若将大量廉价菜籽蛋白转化为人类优质食品蛋白源具有重要社会和经济意义。1蔡氏蛋白的组成和营养成分1.1蛋白质的组成国内外学者对菜籽蛋白组成和结构方面进行广泛而深入研究,为菜籽蛋白提取和利用提供可靠理论依据。通常菜籽蛋白并不是单指一种蛋白质,而是指存在于油菜籽中多种蛋白质总称,菜籽蛋白80%以上蛋白质是贮存蛋白,其余为膜蛋白。有利用价值的是贮存蛋白,系由60%~70%球蛋白、20%~25%精蛋白和2%~3%醇溶蛋白组成。菜籽蛋白包括两类主要种子储藏蛋白质:12S球蛋白(cruciferin)和2S清蛋白(napin),同时含有一些较小蛋白质,如胰岛素抑制剂和脂质转移蛋白(LTP)。12S球蛋白占蛋白总量25%~65%,相对分子质量约为300.0kDa,其等电点为7.2,由α亚基和β亚基配对成6个亚基对组成;α亚基相对分子质量约为30.0kDa,β亚基相对分子质量约为20.0kDa。2S清蛋白占蛋白总量20%,相对分子质量在12.5~14.5kDa之间,其等电点为11.0,由4.0kDa和9.0kDa两条多肽链通过两个二硫键连接而成[4~5]。根据提取分离纯度不同,按产品中蛋白质含量高低,菜籽蛋白也可分为菜籽浓缩蛋白和菜籽分离蛋白。蛋白质由多种氨基酸组成,表1列示菜籽蛋白制品必需氨基酸组成。1.2营养品质方面的影响由表1、表2可看出,菜籽浓缩蛋白具有较好营养特性,其氨基酸组成合理,且含有足够碱性氨基酸和含硫氨基酸,而许多谷物和豆类缺乏这类氨基酸。与其它植物蛋白质相比,菜籽浓缩蛋白优势体现在:(1)氨基酸组成模式比大豆蛋白更理想,与FAO及WHO推荐模式很接近。(2)含硫氨基酸―蛋氨酸、胱氨酸含量比大豆蛋白高。含硫氨基酸在食品感观、营养和生理调节功能方面作用较大,不仅在防褐变、风味形成和质地改善等方面起着重要作用,且具有抗氧化、拮抗化学致癌物和解除蛋白抑制等生理调节功能。(3)菜籽蛋白消化率为95%~100%,生物价高达92,蛋白效价为3.0–3.5,比大豆蛋白(2.25)高,也高于酪蛋白(2.5);因此,是人类和动物理想营养源。(4)含有较高胆碱、生物素、烟酸、维生素B1、B2及丰富微量元素如钙、磷、硒等。2脱毒、去除抗营养因子长期以来,菜籽蛋白开发效果不太理想,是因油菜籽含有硫甙、植酸等抗营养因子,从而大大制约菜籽蛋白开发利用,所以必须考虑脱毒、去除抗营养因子问题。2.1脱除硫呤方法硫甙含量是限制菜籽粕在饲料和食品中应用主要指标。硫甙虽在正常条件下较为稳定;但在酸性、碱性环境、受热及酶作用下都会发生分解生成各种产物,硫甙及其降解产物都具有毒性。过去曾普遍认为,菜籽粕毒性主要来自硫甙水解产物,只有当油菜籽破碎后,相互隔离硫甙与芥子酶相遇,在一定条件下经芥子酶作用使硫甙分解为有毒产物。但1982年Luethy等通过实验提出较新观点,认为造成动物体重下降,肝脏肿大因子并非系硫甙降解产物而是硫甙本身。对于脱除硫甙方法有物理法、化学法、生物法和遗传学方法等,目前研究较多的是微生物发酵法和双液相萃取法。菜籽粕利用微生物发酵脱毒,同时其中成分也转化为小分子蛋白、寡肽、氨基酸、乳酸、维生素和UGF(未知生长因子)等物质。一般高活性生物制剂是由乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌及白地霉等菌株复合而成,利用它发酵处理菜籽粕既可脱除其中有毒成分,又可增加菜籽粕有益成分。此外,热处理能有效降低饲料中硫甙含量,如菜籽粕经蒸汽压力处理后硫甙含量由40μmol/g降至26μmol/g。2.2金属离子螯合剂植酸(phyticacid)即肌醇六磷酸,是植物籽粒中肌醇和磷酸基本贮存形式,难消化、酸性强、具有抗氧化作用。其在菜籽粕中含量为2%~4%,在很宽pH范围内均带负电荷,是一种很强金属离子螯合剂。植酸可与蛋白质结合成复合物,也可与金属离子形成三元复合物,使蛋白质和金属元素有效利用率降低。当饲料植酸含量较高时,易造成禽畜缺锌、铜、钙等金属离子,也会使动物体内产生毒性,主要表现为厌食、消瘦、呆滞、皮毛粗糙等。刘大川等根据植酸在pH为5时溶解度最大而蛋白在等电点(pH=4)附近溶解度小,用pH为5的8倍水浸泡脱脂粕2h以萃取植酸。何国菊等以草酸盐作为钙、镁等离子沉淀剂,破坏菜籽粕中“植酸―多价金属阳离子―蛋白质”三元复合物结构,非常容易实现在中性条件下直接从菜籽粕中提取植酸。2.3酚类物质的氧化菜籽多酚主要包括酚酸与单宁两大类,油菜籽含2%~4%多酚类物质。单宁不但有苦涩味,影响适口性,且在中性和碱性条件下,会被氧化而产生聚合作用,使菜籽粕变黑,并产生不良气味,降低动物采食量。单宁以羟基与蛋白质和碳水化合物生成稳定化合物,单宁与消化酶特别是胰蛋白酶和淀粉酶底物反应或直接与这些酶反应,从而降低蛋白质和碳水化合物利用率。由于酚类物质具有刺激性气味和苦涩味,用作饲料时会影响适口性。酚类物质能与蛋白质形成致密鞣质,还能与金属元素、蛋白质结合形成三元复合物,影响动物对蛋白质和微量元素吸收,降低蛋白质和无机元素有效利用率。酚类物质在中性和碱性条件下很容易发生氧化和聚合作用,使饼粕变黑,如果菜籽蛋白中其含量高,也会造成蛋白颜色发暗,影响蛋白加工利用。有国外学者开发膜壁扩散萃取过程,在脱除硫甙同时可脱除约87%酚类物质;氨的存在亦能使油菜籽中酚含量大幅降低。也有将菜籽粕用化学方法脱毒后用于牲畜配合饲料,一般采用弱酸、弱碱、盐等作为提取剂。3泡菜籽的提取方法3.1最佳工艺条件的确定及菜籽蛋白的提取水相法主要是采用不同水相将蛋白萃取而出,然后在菜籽蛋白等电点附近将蛋白沉淀,再分离干燥制取菜籽分离蛋白。最常用萃取水相是稀碱、水、稀酸、NaCl水溶液及六偏磷酸钠溶液等。刘大川等以“双低”脱皮脱脂菜籽粕为原料,用碱溶酸沉法制备菜籽分离蛋白,通过对各种因素分析得到制备菜籽分离蛋白最佳工艺条件为:在pH为11条件下,用NaOH溶液浸提4次、每次浸提35min、固液比为1∶12、浸提温度为50℃。在此最佳条件下,产品蛋白含量达86.12%,产品得率为24.35%。在碱溶酸沉前,用pH为5的8倍水脱植酸,用85%乙醇、固液比1∶4脱单宁,可制得低植酸、低单宁“双低”菜籽分离蛋白。最近有学者也用碱提酸沉法制备菜籽蛋白,通过对各种因素分析得到菜籽蛋白制备条件,在pH12条件下提取菜籽蛋白,物料比为1∶15,菜籽蛋白沉淀分两步进行,首先在pH6.0条件下进行沉淀,离心后在pH3.6条件下再进行沉淀,收集两次沉淀,经干燥,即可得菜籽蛋白。按此工艺生产菜籽蛋白,提取率为40.7%。此外,以菜籽粕为原料,以水解度为衡量指标,对碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶酶解作用进行比较,确定用碱性蛋白酶进行酶解,水解时间为7h、温度为50℃、酶解液pH8.0、底物浓度为3%时,其菜籽分离蛋白水解度达32.19%。3.2乙醇水浸菜籽粕最佳工艺条件的确定用醇、酮等有机溶剂萃取蛋白是常用去除粕中毒性物质方法。醇类不但去毒除硫甙效果好,还有除去粕中残油、酚、色素等因子、改善产品风味、改变色泽等功效。刘大川等以菜籽粕为原料,用95%乙醇作溶剂,通过改变浸出次数、原料坯厚、原料水分含量、固液比4个因素,在浸出温度78℃、每次浸出15min条件下对菜籽粕进行浸出,对浸出粕中残油率进行检测分析,得出乙醇浸出菜籽粕最佳工艺条件为:浸出次数9次、原料水分含量2.4%、原料坯厚0.50cm、固液比1∶4.0;得到浸出粕中残油率为1.53%、蛋白质含量为45.80%(N×6.25,干基)、单宁含量为1.4%、植酸含量为5.12%、硫甙含量为2.77mg/g。曾晓波分别用乙醇和丙酮溶液作浸提液,采用响应面分析法对影响菜籽浓缩蛋白中蛋白质及多酚含量的提取液浓度、NaCl浓度和pH进行优化,发现用乙醇提取所得蛋白质含量略高于丙酮提取,且多酚含量亦高。但用醇、酮等有机溶剂制备菜籽蛋白方法,由于工艺复杂、成本高及溶剂对蛋白质营养价值影响等问题,进一步工业化生产困难较大。3.3把双酶分步水解菜籽肽水相酶解法主要是利用蛋白酶将菜籽粕中蛋白质充分溶出,改善植物蛋白溶解性、乳化性和起泡性,提高蛋白质营养价值及蛋白质得率,消除油料饼粕有害成分对人体和动物不良影响;但存在植物蛋白经酶水解后产生苦味问题。刘海梅用3,000U/g碱性蛋白酶水解菜籽蛋白4h,再添加3,000U/g木瓜蛋白酶水解4h,提高水解度,并将低肽末端疏水性氨基酸水解形成游离氨基酸,从而降低或消除水解产物苦味,获得无苦味水解产物。为了解菜籽粕蛋白经酶水解后产生苦味程度,在制备菜籽分离蛋白基础上,通过分析计算菜籽蛋白疏水性值,以选择合适水解用蛋白。金晶等选用Alcalase2.4碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶分步水解菜籽蛋白,结果表明,双酶分步水解制备菜籽肽最佳工艺为:Alcalase碱性蛋白酶在pH值9.5、温度55℃、底物质量分数3%、酶活性5,500U/g条件下酶解5.5h,水解度为21.14%;再用复合风味酶在pH值6、温度50℃、酶活性900U/g条件下继续酶解3h。3.4利用优质蛋白饲料史美仁等对油菜籽进行双液相萃取,在提取较高质量菜籽毛油同时,可得到高质量去毒菜籽粕。去毒菜籽粕硫甙被脱除90%以上,色浅味淡、流动性好、蛋白含量高、质量优,可直接用作优质蛋白饲料,并可进一步制取浓缩蛋白和分离蛋白。王车礼等利用饼粕中皮和仁在密度等性质上存在差异,以CaCl2和二氯乙烷为液选剂处理菜籽粕,可获得蛋白含量为60%菜籽浓缩蛋白产品,回收率占油菜籽质量20%。以CaCl2水溶液作为液选剂,干物质损失约9%~15%,蛋白质损失约10%~16%;用二氯乙烷作为液选剂,双液相萃取后加筛分液选工艺可获得蛋白含量为60.5%(干基)、得率为20.2%(占油菜籽)浓缩蛋白产品,干物质和蛋白质基本无损失。3.5菜籽蛋白的提取和分离利用超滤膜对分离组分选择性,截留分子量较大蛋白质分子或相当粒径胶体物质,而溶剂和小分子物质被透过,可将蛋白质浓缩和分离并保留在截留物中。姜绍通等在传统碱提酸沉工艺基础上结合超滤制备菜籽分离蛋白。通过正交试验得到菜籽分离蛋白碱提酸沉条件为:在pH13、温度40℃、料液比(g/mL)分别为1∶10、1∶8和1∶6下提取3次,每次40min,调pH4.5沉淀。上清液超滤工艺条件:40℃、流速2m/s、压力0.1MPa;喷雾干燥后产品粗蛋白含量为70.5%,蛋白得率为54.7%。加拿大多伦多大学开发组合提取菜籽分离蛋白方法。主要包括:碱萃取与洗涤提取粕中蛋白质、等电点沉淀以回收沉淀蛋白(PPD)、超滤浓缩和渗滤纯化得到可溶性蛋白(SPI)四个步骤,该工艺具有高得率、高质量特点。陈全胜等研究利用中空纤维超滤膜分离菜籽粕中蛋白质可行性。基于超滤机理,分析超滤过程中操作压力、溶液温度、质量分数及pH值等参数对膜通量影响。在5%食盐溶液提取基础上,通过超滤试验得到最佳工艺条件:操作压力0.2MPa、溶液温度、质量分数和pH值分别为40℃、7%和10;并提出预防超滤膜污染及清洗方法。试验结果表明,利用中空纤维超滤膜分离菜籽粕中蛋白质是可行的。YumikoYoshie–Stark等制备两种菜籽分离蛋白,并研究菜籽分离蛋白化学组成、功能性质和生物活性。一种菜籽分离蛋白是控制pH值使其沉淀制得;另一种是用超滤技术制备。前者得到蛋白质含量为70.8%,后者则是98.7%。超滤法制备菜籽分离蛋白乳化能力优于全蛋乳化性,其溶解度在pH3~9范围时为52.5%~97.2%;而沉淀法所得分离蛋白溶解度在pH7~9范围时为26.4%。这两种菜籽分离蛋白对抑制ACE活性及结合胆汁酸能力差别不大;但均比脱脂大豆蛋白抑制ACE活性及结合胆汁酸能力低,且这两种菜籽分离蛋白比脱脂大豆蛋白具有更强清除DPPH自由基能力。3.6purage蛋白产品该技术首先用盐溶液从菜籽粕中提取菜籽蛋白,提取物进行超滤浓缩和纯化,浓缩后蛋白溶液用冷水稀释,使一部分蛋白聚集形成胶束,胶束经离心过滤,过滤物再喷雾干燥得到Puratein产品;滤液通过进一步加工和干燥得到Supertein产品,这两种产品蛋白含量可达90%以上。用这种新方法生产蛋白质,不需任何化学药品,产品感官特性及功能性比传统方法生产菜籽蛋白产品为好。该法生产菜籽蛋白产品Puratein具有非常好乳化和胶凝特性,可用于调味品、蛋黄酱或人造肉等;而另一种蛋白产品Supertein具有较好可溶性和很强发泡能力,可用于改良饮料、烘烤食品等。3.7菜籽酶处理单因素试验结果刘志强等对水相酶解法提取菜籽油及菜籽蛋白所得菜籽蛋白液进行超滤处理,研究超滤条件对超滤膜透过速率影响,得出操作压力、温度、料液pH值、料液蛋白质浓度影响较大。试验结果表明,控制操作压力0.20~0.30Mpa、温度50℃、料液pH值9~10时效果较好。采用超滤工艺,所得菜籽蛋白不含毒素、纯度及回收率均在90%以上,且功能特性优于酸沉法。也有学者为提高菜籽蛋白利用率,采用水相酶解法提取菜籽油与菜籽蛋白,以超滤法分离菜籽蛋白,重点对酶处理工艺参数进行研究。试验对各种酶的作用效果进行比较,确定采用纤维素酶、果胶酶按活力比3∶1配方复合酶处理效果较好。由优化试验得出酶处理工艺参数为:固液比1∶5、酶用量30U/g、酶处理时间100min;在此最佳工艺条件下可获得高质量菜籽油与菜籽蛋白,油与蛋白质得率分别为92.6%、82.3%。4腌制食用蛋白在食品行业的应用4.1菜籽蛋白复合涂膜的制备菜籽分离蛋白,特别是改性菜籽分离蛋白具有良好成膜性,在一定条件下,添加适量助剂(如甘油)可制成具有良好隔氧能力和抗水分迁徙性、安全、无毒天然食用保鲜膜,此类膜可广泛应用于糕点、水果、蔬菜、肉制品等保鲜,及糖果制造和医药领域。以菜籽蛋白为主制成天然保鲜膜应用于月饼等糕点保鲜,不仅可有效防止微生物污染,延长保质期,还可防止食品香味物质挥发散失,抑制食品水分逸出,能长时间保持月饼、糕点原有风味和新鲜感。菜籽分离蛋白形成膜,在食品表面形成均匀、致密、透明薄膜,还能增强食品外观光泽,提高食品品质;以改性菜籽分离蛋白为主,复配其它物质果蔬型保鲜剂,利用膜的微孔结构,既抑制果蔬类食品透气和透水性能,发挥一定生理性气调作用,又能抑制果蔬类组织过于旺盛呼吸作用,减少果蔬水分蒸发以使代谢作用降低,也能抵御外界病菌侵入和抑制食品中微生物繁殖,如应用于菠萝和蘑菇保鲜。更为重要的是,以菜籽分离蛋白为主研制天然保鲜膜,具有安全、无毒、成本低等优点,是一类极具开发前景新型天然食品保鲜剂。4.2菜籽蛋白在碎肉中的应用菜籽分离蛋白可作为脂肪替代物、增味剂、乳化剂、组织改良剂,用于火腿肠或传统香肠、午餐肉和肉脯生产,利用菜籽蛋白乳化稳定性和持水功能,可减少制品在加工过程中水