维生素e和维生素c联合染毒对慢性镉中毒小鼠黑质神经元的保护作用

维生素e和维生素c联合染毒对慢性镉中毒小鼠黑质神经元的保护作用

镉（cd）是一种含毒性重金属，在动物体内的半衰期为10-30年。这是已知的最接近身体的有毒物质。镉在工业上用途广泛,随着工业生产的发展,可通过废水、废气、废渣排放到环境中,经被污染的食物、饮用水等多种途径进入人体,对多系统器官造成损害。镉引起的人群慢性镉中毒已经成为一个受到广泛关注的环境健康问题。有研究报道,镉可通过受污染的土壤侵入至稻米中,抽样调查结果显示,中国多地市场上约10%大米镉含量超标。由于我国65%的人口以稻米为主食,因此,在未来的中国农产品安全问题中,重金属污染将取代农药,成为主要的公共卫生问题。贵州是铅、锌矿蕴藏量较为丰富的地区,同时分布着大量的镉,地质分布上列为镉分布区(CP区,包括黔西南和黔西大部分地区)。1985年,柯长茂报道贵州省赫章县天然存在一镉中毒病区,其镉负荷背景与20世纪70年代日本报道的神通川流域“痛痛病”病区的水平相似。近期的流行病学调查显示,该地区20年来镉污染一直存在,且镉的累积水平较高,食物中镉含量高出对照区15倍,尿镉高出对照区8倍。表明赫章县仍是镉污染的重灾区,当地居民的身体健康受到镉污染的严重威胁。近年来的研究发现,镉对神经系统也有明显的毒性作用,不少学者认为,镉可能通过自由基促进细胞脂质过氧化作用,使细胞膜的功能和结构受到损害。笔者的前期研究也表明,慢性镉中毒可致小鼠中脑黑质受损,并提示镉可能是诱发帕金森病的病因之一。维生素E(VE)和维生素C(VC)是一种有效的抗氧化剂,国内外许多资料已证明VE和VC可保护神经组织免受镉引起的自由基增多和氧化反应异常所造成的损害;但是有关形态学方面的研究甚少。本实验研究了VE和VC联合染毒对慢性镉中毒小鼠黑质神经元的保护作用及其形态学改变,为临床防治慢性镉中毒提供实验及形态学依据,对于正确认识和解决镉污染及其引起的地方病及食物安全问题具有重要的社会意义。1材料和方法1.1药物、试剂、培养基氯化镉(CdCl2,分析纯,北京57601化工厂,批号:10873005),维生素E胶囊(纯度>99%,广州白云山制药总厂,批号:H44021557),维生素C注射液(广州白云山明兴制药有限公司,批号:H44022383),酪氨酸羟化酶抗体(武汉博士德生物工程有限公司,批号:BA1454)。氯化镉染毒溶液的配制:准确称取适量的氯化镉溶解于双蒸水中,配制成相应浓度的氯化镉溶液。1.2实验动物的分组选择健康3月龄清洁级雄性昆明小鼠125只,体重为25~35g,由贵阳医学院实验动物中心提供,动物合格证号为SCXX[(黔)2002-0001]。实验室温度为(18±2)℃,相对湿度为48%~60%。实验期间,给予标准颗粒饲料及蒸馏水喂养,小鼠可自由摄食、饮水。将实验动物按体重随机分为5组,分别为正常对照(生理盐水)组、镉中毒(以2mg/kg氯化镉溶液经皮下注射染毒,染毒容量为5ml/kg,每周2次)组、镉中毒+VE(以10mg/kgVE溶液经口灌胃染毒,染毒容量为10ml/kg,每天1次)组、镉中毒+VC(以25mg/kgVC溶液经口灌胃染毒,染毒容量为15ml/kg,每天1次)组、镉中毒+VE+VC组,每组25只。连续染毒3个月。每周称重小鼠体重,观察一般情况。1.3观察方法th取整个中脑,用Bouin液进一步固定,石蜡包埋、切片,分别进行HE染色、尼氏法染色和酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化ABC法染色,在光镜下进行观察。其中,TH免疫组化染色的切片采用Biomias99图像分析系统(四川大学图像图形研究所),在10×40倍的视野下测量TH阳性反应神经元的二维形态参数(面积、周长、最大直径、等效圆直径、平均光密度);进一步运用体视学的方法计算出三维形态参数(体密度、数密度、平均截面积、平均体积、圆球度)。每组随机取3只小鼠脑组织黑质区域1mm3大小组织块,按常规方法制作切片,在电镜下进行观察。1.4方差分析方法实验数据均以ue0af±s进行表示。采用SPSS10.0软件进行统计学分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(OneWayANOVA)。进一步进行组间两两比较时,若方差齐时,采用SNK检验(Student-Newman-Keuls法);若方差不齐时,采用Games-Howell检验。以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1大学生努力及体重检测正常对照组小鼠活动度大,饮食正常。镉中毒组小鼠染毒2周后出现活动减少,行动迟缓,无精打采,饮食量下降等情况;少数小鼠步态不稳,且有两只小鼠出现向一侧定向旋转的现象。镉中毒+VE组小鼠活动未见明显减少,饮食正常。镉中毒+VC组小鼠活动未见明显减少,饮食量稍有下降。镉中毒+VE+VC组小鼠活动亦未见明显减少,饮食量稍有下降。VE和VC染毒慢性镉中毒小鼠体重的变化见表1。从表1看出,染毒后第1、2、3个月,与镉中毒组比较,正常对照组、镉中毒+VE组、镉中毒+VC组、镉中毒+VE+VC组小鼠体重均较高,差异有统计学意义(P<0.05);而正常对照组、镉中毒+VE组、镉中毒+VC组、镉中毒+VE+VC组小鼠体重间比较,差异无统计学意义。2.2镉两种方法对黑质区神经元形态的影响VE和VC染毒慢性镉中毒小鼠脑组织黑质区HE染色后的病理改变见封三图1。封三图1可见,正常对照组黑质区域细胞密集成群,神经元胞体及胞核较大,核仁清晰,胞浆比较丰富(封三图1A)。镉中毒组黑质区神经元数量明显减少,胞体变形,少数细胞核固缩,胞浆减少,胞浆内可见大小不等的嗜酸性颗粒。其中,9只小鼠黑质区域可见较大的软化灶;大部分小鼠黑质区域内尚见广泛的淋巴细胞浸润,9只小鼠部分淋巴细胞围绕在血管周围形成血管套(封三图1B、C)。与正常对照组相比,镉中毒+VE组细胞形态无明显变化,黑质区神经元未见明显减少,但有少数神经元变性。其中,2只小鼠黑质区有散在软化灶形成,但病灶较小;黑质区可见弥漫性淋巴细胞浸润,偶见淋巴细胞围绕在小血管周围但并未形成血管套(封三图1D、E)。镉中毒+VC组黑质区神经元有少量减少,部分神经元变性,细胞呈圆形或卵圆形,少数细胞出现核固缩及核溶解,胞浆内未见嗜酸性颗粒出现。其中,5只小鼠黑质区有散在软化灶形成,软化灶较镉中毒+VE组为更广泛,面积更大,灶内大多数神经元消失,残留神经元胞体变小,胞核固缩;2只小鼠黑质区可见弥漫性淋巴细胞浸润,形成血管套(封三图1F、G)。镉中毒+VE+VC组黑质区神经元形态基本正常,部分神经元变性,细胞呈圆形或卵圆形,少数细胞出现核固缩及核溶解,胞浆内未见嗜酸性颗粒出现。其中,3只小鼠黑质区有散在软化灶形成,灶内大多数神经元消失,残留神经元胞体变小,胞核固缩;2只小鼠黑质区可见弥漫性淋巴细胞浸润,形成血管套。2.3胞浆内尼氏体检测VE和VC染毒慢性镉中毒小鼠脑组织黑质区尼氏染色后的病理改变见封三图2。封三图2可见,正常对照组黑质区域有成群分布的大多角形或锥体形细胞,胞浆内尼氏体丰富(封三图2A);镉中毒组黑质区神经元明显减少,胞浆内尼氏体减少或消失,着色浅(封三图2B);镉中毒+VE组细胞形态大多正常,胞浆内尼氏体未见明显减少(封三图2C);镉中毒+VC组细胞形态大多正常,胞浆内尼氏体有所减少(封三图2D);镉中毒+VE+VC组细胞形态大多正常,胞浆内尼氏体有少量减少(封三图2E)。2.4镉立克氏原螯虾体内th阳性反应颗粒VE和VC染毒慢性镉中毒小鼠脑组织黑质区TH免疫组化染色后的病理改变见封三图3。封三图3可见,正常对照组黑质区出现大量的TH阳性细胞,胞浆内有丰富的棕黄色TH阳性反应颗粒(封三图3A);镉中毒组黑质区TH阳性细胞明显减少,胞浆内TH阳性反应颗粒较少(封三图3B);镉中毒+VE组黑质区有大量TH阳性反应神经元,胞浆内有丰富的TH阳性反应颗粒(封三图3C);镉中毒+VC组黑质区有大量TH阳性反应神经元,胞浆内TH阳性反应颗粒有所减少(封三图3D);镉中毒+VE+VC组黑质区有大量TH阳性反应神经元,胞浆内TH阳性反应颗粒较正常组稍有减少(封三图3E)。2.5核周质内细胞器的变化VE和VC染毒慢性镉中毒小鼠脑组织黑质区病理改变的电镜观察结果见图4~8。正常组神经元胞体较大,核周质内有较发达细胞器(图4)。镉中毒组神经元胞体缩小,胞核浓缩变形,核染色质边聚,核膜断裂;核周隙可见扩张,核周质内细胞器减少或消失(图5)。镉中毒+VE组神经元胞体较大,核呈圆形或椭圆形,核内染色质松散,均匀分布,未见染色质边聚,核膜清晰完整;核周质内可见大量粗面内质网、游离核糖体及线粒体等细胞器(图6)。镉中毒+VC组神经元胞体缩小,核膜边界清晰,核染色质轻度边聚,核周细胞器减少,线粒体轻度肿胀,偶见空泡化(图7)。镉中毒+VE+VC组神经元结构基本正常,核膜边界清晰有轻度皱褶,未见核染色质边聚,核周质内可见大量线粒体等细胞器(图8)。2.6各组小鼠脑电th临床疗效比较VE和VC染毒慢性镉中毒小鼠脑组织黑质区神经元胞核形态学参数的变化见表2。由表2可见,与正常对照组比较,镉中毒组小鼠脑组织黑质区TH阳性反应神经元细胞核体密度、数密度、平均截面积、平均体积均较低,差异有统计学意义(P<0.05);镉中毒+VE、镉中毒+VC、镉中毒+VE+VC组体密度以及镉中毒+VC组平均截面积均较高,差异有统计学意义(P<0.05)。与镉中毒组比较,镉中毒+VE、镉中毒+VC及镉中毒+VE+VC组小鼠脑组织黑质区TH阳性反应神经元细胞核体密度、数密度、平均截面积、平均体积均较高,差异有统计学意义(P<0.05)。各组小鼠脑组织黑质区TH阳性反应神经元细胞核圆球度间比较,差异无统计学意义。3维生素b.镉解决方案检测镉的中毒机制比较复杂,镉所诱导的氧化损伤已成为镉毒性机制的主要方面。慢性镉中毒可致动物神经系统损伤,而抗氧化剂(如VE、VC等)可抑制镉的毒性作用。笔者的前期研究也已证明,慢性镉中毒可致小鼠中脑黑质受损。本研究旨在进一步从形态学角度探讨并比较VE和VC单独或联合染毒对慢性镉中毒小鼠中脑黑质的保护作用。本实验结果显示,VE和VC单独或联合染毒的慢性镉中毒小鼠不仅精神行为表现正常,而且黑质区神经元的变性、退化及坏死程度均明显改善;与镉中毒组比较,黑质神经元细胞核体密度、数密度、平均截面积、平均体积等形态学参数也明显升高。这些变化说明,经VE、VC及VE+VC处理后的慢性镉中毒小鼠中脑黑质神经元的损伤程度明显改善,结构和功能接近正常。本实验结果还显示,维生素干预对镉中毒的干预效果依次为VE>VE+VC>VC,其主要表现在:(1)软化灶:镉中毒+VE组2只小鼠黑质区有散在软化灶形成,病灶较小;镉中毒+VE+VC组3只小鼠有散在软化灶形成,灶内大多数神经元消失,残留神经元胞体变小,胞核固缩;镉中毒+VC组3只小鼠有软化灶形成,软化灶较镉中毒+VE组和镉中毒+VE+VC组更为广泛,面积更大。(2)血管套:镉中毒+VE组黑质区淋巴细胞围绕在小血管周围,但并未形成血管套;镉中毒+VE+VC组有弥漫性淋巴细胞浸润小血管周围,形成血管套的有2只小鼠;镉中毒+VC组血管套的面积更大,淋巴细胞浸润更广泛,形成血管套的有2只。(3)尼氏染色:镉中毒+VE组胞浆内尼氏体未见明显减少;镉中毒+VE+VC组细胞形态大多正常,胞浆内尼氏体仅有少量减少;镉中毒+VC组胞浆内尼氏体有所减少。(4)TH免疫组化染色:镉中毒+VE组黑质区有大量TH阳性反应神经元,胞浆内TH阳性反应颗粒丰富;镉中毒+VE+VC组TH免疫组化染色黑质区有大量TH阳性反应神经元,胞浆内TH阳性反应颗粒较正常组稍有减少;而镉中毒+VC组胞浆内TH阳性反应颗粒有所减少。(5)电镜观察:镉中毒+VE组神经元结构正常,细胞核形态规则,核膜较光滑,核仁清晰,未见染色质边聚,胞浆中细胞器丰富;镉中毒+VE+