体外构建3D人工皮肤

www.CRTERwww.CRTER.org刘钰，等.体外构建3D人工皮肤www.CRTERwww.CRTER.org刘钰，等.体外构建3D人工皮肤PAGE6918P.O.Box10002PAGE3P.O.Box1200,中国组织工程研究第20卷第46期2016–11–11出版www.CRTER.orgChineseJournalofTissueEngineeringResearchNovember11,2016Vol.20,No.46www.CRTER.org··研究原著·PAGE6915ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH体外构建3D人工皮肤刘钰，沈冲，孟琴(浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江省杭州市310027)引用本文：刘钰，沈冲，孟琴.体外构建3D人工皮肤[J].中国组织工程研究，2016，20(46):6915-6921.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.46.010ORCID:0000-0002-4320-9221(刘钰)文章快速阅读：3D人工皮肤的体外构建3D人工皮肤的体外构建刘钰，女，1991年生，江西省丰城市人，汉族，硕士，主要从事组织工程研究。刘钰，女，1991年生，江西省丰城市人，汉族，硕士，主要从事组织工程研究。通讯作者：孟琴，教授，浙江大学化工系联合反应所，浙江省杭州市310027中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)46-06915-07稿件接受：2016-0结果表明，将角质细胞接种于牛尾胶原包埋的成纤维细胞上，可构建更好的人工皮肤将角质细胞接种于含鼠尾(或牛尾)胶原包埋的成纤维细胞上培养结果表明，将角质细胞接种于牛尾胶原包埋的成纤维细胞上，可构建更好的人工皮肤将角质细胞接种于含鼠尾(或牛尾)胶原包埋的成纤维细胞上培养7d，再气提培养7d，获得人工皮肤从儿童包皮组织中分离培养原代成纤维细胞和角质细胞从牛尾和鼠尾中分别提取与纯化胶原牛尾从儿童包皮组织中分离培养原代成纤维细胞和角质细胞从牛尾和鼠尾中分别提取与纯化胶原牛尾(或鼠尾)胶原包埋成纤维细胞，构建真皮层文题释义：角质细胞培养方法：目前有2种方法，一种用特定的无血清培养基，如M199、F12MCDB153、KSFM、KGM，优点是无需饲养层细胞、培养方法简便易行；一种用鼠成纤维细胞系(NIH3T3)或者鼠胚胎成纤维细胞作饲养层，角质细胞铺在丝裂霉素C处理过的成纤维细胞饲养层上，优点是培养基含血清和高钙，细胞生长快传代方便，缺点是细胞更容易分化，传代次数低于3次。体外构建人工皮肤：最初用饲养层来构建二维共培养模型，缺点是形成的皮肤寿命短，不能形成几层有序的角质层。其次将角质细胞种植于胶原包埋的成纤维细胞上，浸没培养7d，随后气提培养获得人工皮肤，这一方法存在皮肤构建过程中胶原降解、胶原易收缩的缺点。目前已有研究采用3D打印人工皮肤，不过存在成本高、成功率不高、皮肤表皮层不能分化为多层等缺陷。摘要背景：已有研究采用3D打印人工皮肤，但存在皮肤表皮层不能分化为多层等缺陷。目的：优化人工皮肤的构建方法，获得更好的人工皮肤。方法：从牛尾和鼠尾中分别提取与纯化胶原。从儿童包皮组织中分离培养原代成纤维细胞和角质细胞，再以牛尾(或鼠尾)胶原包埋成纤维细胞，构建真皮层；将角质细胞接种于含鼠尾(或牛尾)胶原包埋的成纤维细胞上培养7d，再气提培养7d，获得人工皮肤。观察人工皮肤的收缩性、水接触角，并进行苏木精-伊红染色、天狼猩红染色及免疫荧光染色。结果与结论：①鼠尾胶原构建人工皮肤真皮层面积下降了50%，牛尾胶原构建人工皮肤真皮层面积只下降了21%；②牛尾胶原构建人工皮肤的接触角与人皮肤接近，比鼠尾胶原构建人工皮肤的疏水性更好；③天狼猩红染色结果显示，与鼠尾胶原构建的人工皮肤相比，牛尾胶原构建人工皮肤的胶原折光性更强，胶原排列更有序，纤维更粗；④苏木精-伊红染色显示，与鼠尾胶原构建人工皮肤相比，牛尾胶原构建人工皮肤真皮层的表皮可形成更多层；⑤结果表明，将角质细胞接种于牛尾胶原包埋的成纤维细胞上，可构建更好的人工皮肤。关键词：组织构建；组织工程；人工皮肤；角质细胞；成纤维细胞；胶原；细胞角蛋白14；饲养层；表皮；国家自然科学基金主题词：皮肤，人工；成纤维细胞；胶原；组织工程基金资助：国家自然科学基金(21476197)PAGE6917ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4P.O.Box1200,Shenyang110004kf23385083@Artificialskinpreparationusingthree-dimensionalprintinginvitroLiuYu,ShenChong,MengQin(SchoolofChemicalEngineeringandBiologicalEngineering,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,ZhejiangProvince,China)图4不同胶原构建人工皮肤的苏木精图4不同胶原构建人工皮肤的苏木精-伊红染色结果(×100)Figure4Hematoxylin-eosinstainingoftheartificialskinconstructedwithdifferentcollagens(×100)图注：图中A为牛尾胶原构建人工皮肤，可见含基质层、棘层、肉芽层、角化层的完整表皮；B为鼠尾胶原构建人工皮肤，表皮层只有2层，基质层和角化层。Figure5Paraffinsectionsoftheartificialskinconstructedwithdifferentcollagens(siriusredstaining,×50)图注：图中A为牛尾胶原构建人工皮肤，Ⅰ型胶原排列紧密，纤维粗；B为鼠尾胶原构建人工皮肤，胶原排列疏松，纤维细。2.63D人工皮肤组织的免疫荧光染色观察将牛尾胶原构建人工皮肤组织进行角蛋白CK14、CK1、Ⅳ型胶原免疫荧光学染色，其中CK14可表征皮肤的基质层，CK1可显示上面的肉芽层和角化层，Ⅳ型胶原可现实真皮层与表皮层的连接部位基层，见图6。图6图6牛尾胶原构建人工皮肤的免疫荧光染色(×100)Figure6Immunofluorescencestainingoftheartificialskinconstructedbybovinetailcollagen(×100)图注：图中A为角质细胞角蛋白CK14阳性表达，位于表皮基质层；B为角质细胞角蛋白CK1阳性表达，位于表皮的棘层与肉芽层；C为Ⅳ型胶原阳性表达，位于表皮与真皮结合处。3讨论Discussion能否构建完整的分化多层的皮肤，成纤维细胞和角质细胞的增殖能力至关重要。不少文献在分离表皮与真皮用胰酶消化，处理效果并不好[22]。实验分别用胰酶和Ⅰ型胶原是一种天然的生物可降解材料，虽然胶原的理化性质较差，存在力学强度低、易收缩、易降解等缺点[30]，但具有良好的生物学性能，被广泛用于组织工程支架、基质材料[31]，已在临床多个领域得到应用，如可吸收缝合线、人工皮肤。胶原由α、β链组成的单聚体和二聚体组成[32]，在透射电镜下，胶原由相互交织的胶原原纤维组成，有规则的横纹存在[33]，鼠尾Ⅰ型胶原的纤维丝直径280μm，牛Ⅰ型胶原和鼠尾Ⅰ型胶原在透射电镜下结构类似，牛尾胶原纤维丝的直径和鼠尾胶原略有不同，在5-15nm范围差异不等[34]。人工皮肤的真皮层往往收缩很严重，甚至收缩至原来面积20%[35]。其收缩受多种因素影响[36]，如细胞密度、胶原浓度、血清等，有研究用不降解支架和成纤维细胞、角质细胞共培养构建3D人工皮肤[37]，但是基于胶原可以通过调节pH温度自行凝固而不需添加交联剂的优点，胶原包埋成纤维细胞作为真皮层应用广泛。实验发现与鼠尾胶原相比，牛尾胶原收缩会明显降低，角质细胞分别接种在这2种真皮层，牛尾胶原、成纤维细胞、角质细胞构建的皮肤更大，可更好解决皮肤移植时皮肤量不足的问题，牛尾胶原构建的皮肤收缩性比鼠尾胶原小，猜测这与胶原性质有关，如胶原纤维粗细、胶原凝胶支架的孔隙。细胞在这两种胶原基质中的生长能力也会影响胶原的收缩，文献[15]发现两种胶原支架的孔隙相差不大，均由α、β链组成，人牙龈成纤维细胞在鼠尾胶原支架上的生长增殖能力优于牛尾胶原支架，这可能导致牛尾胶原支架收缩显著下降。通过苏木精-伊红染色观察构建的人工皮肤，可在显微镜中看到包含完整真皮与表皮层的皮肤，上层是表皮层，下层是真皮层，表皮层比真皮层薄，与文献[38]报道的结果基本一致，牛尾Ⅰ型胶原构建真皮层的表皮可形成更多层。免疫荧光染色分析构建的人工皮肤，结果与文献[38-40]基本一致。天狼猩红染料与胶原分子结合，长轴平行，可在偏振纤维镜下加强双折射，且与不同类型胶原结合，颜色会不一，可特异性的表征胶原类型，定位胶原及胶原粗细，被广泛用于组织中胶原形态观察及组织纤维化、组织病变形态观察[17，41]，天狼猩红染色比马松三色染色效果更好。天狼猩红染色结果显示，与鼠尾胶原构建的皮肤相比，牛尾Ⅰ型胶原构建的皮肤真皮层胶原折光性更强，胶原排列更有序，纤维更粗，由此推测这和角质细胞的增殖分化相关，牛尾胶原基质更有利于角质的增殖分化，从而长成更多层皮肤。实验构建的人工皮肤包含成纤维细胞和角质细胞，可用于临床移植皮肤，也可用于皮肤病的治疗，人工皮肤替代物可加快慢性愈合如糖尿病足廯的治疗，但由于缺少血管内皮细胞，造成伤口血管新生延迟，不利于伤口处的皮肤再生。因此可构建出含成纤维细胞、血管内皮细胞、角质细胞的人工皮肤，将成纤维细胞与血管内皮细胞包埋在牛胶原，构建真皮层，角质接种在真皮层，最终气提培养得到完整的人工皮肤。结论：用丝裂霉素C处理的原代成纤维细胞作为饲养层比NIH3T3饲养层更有利于角质细胞的生长，而且饲养层的接种细胞浓度为1×108L-1时，原代角质细胞的生长及克隆效率最优，且比无血清条件下的原代角质细胞生长快，成本低；实验分别采用牛尾Ⅰ作者贡献：通讯作者进行实验设计，第一作者实施评估，结果分析，成文，审校。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：皮肤供者家属对实验知情同意。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4参考文献ReferencesBouwstraJA,Honeywell-NguyenPL.Skinstructureandmodeofactionofvesicles.AdvDrugDelivRev.2002;54Suppl1:S41-55.GreenH,KehindeO,ThomasJ.Growthofculturedhumanepidermalcellsintomultipleepitheliasuitableforgrafting.ProcNatlAcadSciUSA.1979;76(11):5665-5668.BellE,IvarssonB,MerrillC.Productionofatissue-likestructurebycontractionofcollagenlatticesbyhumanfibroblastsofdifferentproliferativepotentialinvitro.ProcNatlAcadSciUSA.1979;76(3):1274-1278.LeeV,SinghG,TrasattiJP,etal.Designandfabricationofhumanskinbythree-dimensionalbioprinting.TissueEngPartCMethods.2014;20(6):4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