红霉素耐药肠球菌

文献标识码：A红霉素耐药肠球菌ermB基因检测刘晶，翟燕红，赵娟※（首都医科大学附属北京妇产医院检验科，北京100026）摘要：目的研究我院临床感染患者分离的肠球菌对红霉素的耐药情况以及耐药基因ermB的分布特点。方法对临床分离的50株肠球菌进行菌株鉴定、表型测定和ermB基因检测。结果50株肠球菌中，粪肠球菌39株（78%），屎肠球菌11株（22%）；红霉素耐药率为88%（44株/50株）。在44株红霉素耐药肠球菌中，ermB基因总的携带率为84.09%（37株/44株）。结论我院临床标本中分离的红霉素耐药的肠球菌主要耐药基因为ermB基因。关键词：肠球菌；红霉素；耐药基因肠球菌为革兰氏阳性菌，是肠道内的定植菌，也是重要的条件致病菌和院内感染常见的病原菌，不仅能引起泌尿系感染，还能引起心内膜炎、败血症、腹腔感染及皮肤伤口感染。由于肠球菌对三代头抱菌素、氨基糖苷类（高水平除外）、磺胺类、克林霉素等具有天然耐药性，同时易被诱导产生新的耐药，因此对于肠球菌引起的感染所能提供选用的抗生素非常有限，红霉素常被选用于肠球菌感染引起的治疗。近几年，我院临床感染的肠球菌不断增加，随着广谱抗生素的广泛应用，肠球菌耐药情况变得日益严重，尤以红霉素为重。本研究收集我院临床感染的50株肠球菌进行分类、红霉素表型分析及ermB基因检测。1材料与方法1.1临床分离株：来自2008年1月-2010年2月北京妇产医院住院患者临床标本中分离的病原菌，共50株，同一患者重复菌株选择首次分离菌。来自阴道、宫颈分泌物29株，伤口分泌物6株，血液5株，胎盘母面、子面及新生儿咽5株，盆腔、腹腔引流滋株，尿液2株及肛拭子1株。其中，粪肠球菌39株，屎肠球菌11株，未分离到其他种的肠球菌。质控菌株：粪肠球菌（ATCC29212）购自卫生部临床检验中心。1.2试剂与仪器：MH琼脂培养基（天津市金章科技发展有限公司），红霉素药敏纸片（英国Oxoid公司生产）；细菌基因组提取试剂盒及PCR检测试剂盒（上海生工生物工程公司）。全自动MicroscanWalkAway40型微生物鉴定/药敏仪（美国德灵公司）；Bactec9050血培养仪（美国B-D公司）；MyCyclerPCR扩增仪（美国Bio-Rad公司）；POWERNPAC200水平电泳仪（美国Bio-Rad公司）；GIS2010Tanon数码图像处理系统（上海天能科技有限公司）；SANYOMCO175二氧化碳孵育箱（日本三洋公司）。1.3方法1.3.1药物敏感性试验采用MH琼脂培养基＞K-B纸片药敏试验。判断标准采用美国CLSI/NCCLS（2006年）判断结果。35°C培养24小时，红霉素药敏试验抑菌环直径M13mm为耐药、沱23mm为敏感。1.3.2细菌鉴定及基因检测用MicroscanWalkAway40型微生物鉴定/药敏仪进行菌株鉴定。基因模板制备：按照上海生工基因组提取试剂盒操作进行，所得上清液即为扩增的模板液。ermB基因引物序列见表1。表1ermB基因PCR引物序列靶基因 序列（5,-3'） 产物长度（bp）ermB P1：GAAAAGGTACTCAACCAAATA616bpP2：AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC1.3.3PCR反应25pl反应体系：模板5pl,引物0.5pl,dNTP100mol/L,其他成分按常规配比加入；ermB基因的热循环参数：94C预变性2min,94C变性30s,52C退火1min,72C延伸1min,35个循环，再72C延伸10min。取PCR产物5pl置2%琼脂糖凝胶电泳后，在UV灯下观察结果。2结果2.1红霉素耐药性50株肠球菌对红霉素的耐药率为88%（44/50株），粪肠球菌对红霉素的耐药率为84.6%（33/39株），屎肠球菌对红霉素的耐药率为100%（11/11株）。2.2ermB基因的检测结果44株红霉素耐药肠球菌检出37株ermB基因阳性，占84.09%,3株红霉素中介肠球菌检出3株ermB基因阳性，占100%,3株红霉素敏感肠球菌未检出ermB基因。3讨论肠球菌是医院感染常见的病原菌之一，近年来，其引起的感染逐年增加。由于肠球菌对多种抗生素耐药，使得肠球菌的感染变得复杂。目前，肠球菌对大环内酯类抗生素的耐药性比较严重，其耐药机制涉及两个方面：药物靶位的改变和抗生素的主动外排⑴。现在尚未发现肠球菌能够灭活大环内酯类抗生素。erm基因可编码红霉素甲基化酶，使细菌的红霉素作用靶位发生改变，从而导致细菌对大环内酯类、林可霉素、链阳霉裁（MLSB）耐药。肠球菌中的erm主要是ermB基因，Luna等⑵发现ermB的存在与肠球菌的高红霉素耐药相关；Portillo等⑴研究表明，ermB基因出现频率最高，与大环内酯类耐药表型相一致。本研究中，44株红霉素耐药肠球菌ermB基因的携带率为84.09%，与国内报道⑶大致相同，但高于吕萍等人报道⑷。3株红霉素中介肠球菌ermB基因的携带率为100%，而3株红霉素敏感肠球菌中未检测到ermB基因。由此可见，ermB基因是肠球菌对大环内酯类抗生素耐药的重要基因；在其他对红霉素耐药而未检测到ermB基因的肠球菌中，最近由国外学者在试验室将另一亚型一ermA基因转入肠球菌而导致红霉素耐药的报道⑸，本文中，有15.91%红霉素耐药肠球菌ermB基因阴性，是否存在其他耐药基因我们将做进一步研究。肠球菌的一些耐药基因编码转运(外排)蛋白，可以把抗生素泵出细胞，使细胞内抗生素浓度降低，导致耐药⑹。大环内酯类外排基因(mef基因)已经分离出mefA基因和mefE基因，其外排泵的特异性底物是14元环(红霉素、克拉霉素)和15元环(阿齐霉素)大环内酯类抗生素。Fraimow等[71研究表明，耐大环内酯肠球菌株中42%携带mefA基因。然而，Portillo等⑴在肠球菌中没有发现mefA基因或mefE基因，我们即将进入这一部分研究。目前，肠球菌属已是我院感染分离率较高的细菌，由于标本来源接近60%(29/50株)为阴道及宫颈分泌物，如不及时治疗可以导致产妇胎膜早破，宫内感染，新生儿呼吸窘迫等一系列问题，同时红霉素耐药率不断攀升，我们必须引起高度重视。本研究从基因水平着手，对其耐药机制进行分析，以期指导临床合理应用抗生素，争取做到及时有效的治疗。参考文献PortilloA,Ruiz-LarreaF,ZarazagaM,etal.MacrolideresistancegenesinEnterococcusspp[J].AntimicrobAgentsChemother,2000,44(4):967-971.LunaVA,CoatesP,EadyEA,etal.AvarietyofGram-positivebacteriacarrymobilemefgenes[J].JAntimicrobChemother,1999,44(1):19-25.王珊，郑波，李耘，等。耐红霉素屎肠球菌耐药基因及其水平转移研究[J]。中国抗生素杂志，2009，34(12)：739-742。吕萍，徐樨巍，宋文琪，等。红霉素耐药肠球菌ermB基因与转座子Tn1545和Tn917的关系[J]。中华微生物和免疫学杂志，2007，27(8)：730-733。GiovanettiE,MagiG,BrencianiA,etal.ConjugativetransferoftheermAgenefromerythromycinresistantStreptococcuspyogenestomacrolidesusceptible.S.pyogenes,Enterococcusfaecalisandlisteriainnocua.JAntimicrobChemother,2002,50(2):249-252.王玉宝，宋诗铎。肠球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制[J]。国外医药抗生素分册，2003，24(1)：5-6转17。FraimowH,KnobC.AmplificationofmacrolideeffluxpumpsmsrandmeffromEnteroco