《生物化学》课件 第14章 dna的生物合成

第14章DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)PutianUniversity112级临本第14章DNA的生物合成PutianUniversity1复制(replication)：是指由亲代DNA为模板合成两个相同的子代DNA的过程。复制亲代DNA子代DNADNA的生物合成的方式：⑴DNA自我复制⑵DNA修复合成⑶逆转录合成PutianUniversity212级临本复制(replication)：是指由亲代DNA为模板合成DNA复制的基本特性characteristicsofDNAReplication第一节PutianUniversity312级临本DNA复制的基本特性第一节PutianUniversi半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)DNA复制的主要特征PutianUniversity412级临本半保留复制(semi-conservativereplic一、半保留复制半保留复制：指DNA复制时，母链DNA双螺旋结构解开为两条单链，并各自作为模板，以四种dNTP为原料，按照碱基互补配对原则合成与之互补的新链。使在子代DNA双链中一条来自于亲代，另一条是新合成。这种复制方式称半保留复制。1、半保留复制概念3、半保留复制的意义体现了遗传的保守性。2、半保留复制的实验证据Meselson和Stahl密度梯度实验

PutianUniversity512级临本一、半保留复制半保留复制：指DNA复制时，母链DNA双螺旋Meselson和Stahl密度梯度实验

——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮N15-DNA的细菌培养于普通培养液（N14）

第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果半保留复制证据PutianUniversity612级临本Meselson和Stahl密度梯度实验——实验结果支持二、DNA复制的方向和方式1、DNA复制的方向：由5′→3′方向合成以双向复制为主。2、DNA复制的方式：大多数原核和真核生物复制时，DNA都是从固定起始点(原核一个起点，真核多个起点)开始向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制方式，即为双向复制。复制叉PutianUniversity712级临本二、DNA复制的方向和方式1、DNA复制的方向：由5′→3通常把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)

。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’真核细胞一个复制子复制子(replicon)5’5’3’复制3’ori原核细胞一个复制子PutianUniversity812级临本通常把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replico因为催化DNA合成的DNA聚合酶只能以5‘→3’方向合成子代DNA链决定模板DNA链的方向必须是3‘→5’。三、半不连续复制半不连续复制是指DNA复制时，以3′→5′方向为模板合成新链时是连续合成的。而以5′→3′方向为模板合成新链时是不连续合成的。PutianUniversity912级临本因为催化DNA合成的DNA聚合酶只能以5‘→3’方向三、半领头链与随从链领头链(leadingstrand)：以3’→5’方向的亲代DNA链为模板连续合成的子代链称为领头链。随从链(laggingstrand)：以5’→3’方向的亲代DNA链为模板不连续合成的子代链称为随从链。随从链由不连续片段组成。不连续片段称冈崎片段(Okazakifragment)PutianUniversity1012级临本领头链与随从链领头链(leadingstrand)：以3’DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节TheEnzymologyandTopologyofDNAReplicationPutianUniversity1112级临本DNA复制的酶学第二节TheEnzymologyanDNA复制的反应体系组成:底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):解开成单链的DNA母链；引物(primer):提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶(解螺旋酶、拓扑异构酶、引物酶、DNA连接酶)和蛋白质因子(单链DNA结合蛋白)。PutianUniversity1212级临本DNA复制的反应体系组成:底物(substrate):d一、DNA聚合酶聚合的功能：催化3，5磷酸二酯键的形成核酸外切水解酶的功能全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)。简称：DNA-polDNA聚合酶的功能(活性)3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性1、聚合反应具有方向性:5

3

2、聚合反应具有模板依赖性DNA聚合酶聚合反应特点3、DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合，

DNA新链生成需引物参与PutianUniversity1312级临本一、DNA聚合酶聚合的功能：催化3，5磷酸二酯键的形成核3'

ATGCAATTGC5'||||5

TACGppi

TDNA聚合酶的5

至3

的聚合活性

dTTP3'(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+ppi

dTTPppi

T引物DNA聚合酶PutianUniversity1412级临本3'ATGCA3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性能切除突变的DNA片段能辨认错配的碱基对，并将其水解DNA聚合酶的核酸外切酶活性5’AGCTTCAGGATA

3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’?PutianUniversity1512级临本35外切酶活性53外切酶活性能切除(一)原核生物的DNA聚合酶原核生物DNA聚合酶有三种：DNA-polⅠ、DNA-polⅡ、DNA-polⅢ功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）木瓜蛋白酶N端C端DNA-polⅠ小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性PutianUniversity1612级临本(一)原核生物的DNA聚合酶原核生物DNA聚合酶有三种：DNDNA-polⅡ（120kD）DNA-polⅡ功能不详，有研究表明它可能参与DNA损伤的应急状态修复。DNA-polⅢ(250kD)原核生物DNApolⅢ全酶由10种(α、ε、θ、τ、γ、δ、δ´、β、κ、ψ)22个亚基构成不对称二聚体。DNA-polⅢ是原核生物DNA真正的复制酶。作用是在领头链和随从链的引物上进行DNA的延伸。PutianUniversity1712级临本DNA-polⅡ（120kD）DNA-polⅡ功能不详，核心酶含α、ε、θ三亚基α亚基分别催化领头链与随从链的合成ε亚基有3´→5´外切酶活性及对碱基的选择功能θ亚基为装配所必需β亚基起着夹住模板又能使酶延模板滑动的作用。DNA-polⅢPutianUniversity1812级临本核心酶含α、ε、θ三亚基α亚基分别催化领头链ε亚基有3´→DNA-pol

起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

(二)真核生物的DNA聚合酶PutianUniversity1912级临本DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，原因：DNA聚合酶对模板的依赖性，是子链与母链能准确配对的保证。复制过程中，DNA复制的保真性至少依赖三种机制：1、遵守严格的碱基配对规律2、聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能3、复制出错时DNA-pol的及时校读功能二、复制的保真性(fidelity)复制的保真性是指复制产生的子代DNA的碱基序列与亲代DNA的碱基序列所保持的一致性。PutianUniversity2012级临本原因：DNA聚合酶对模板的依赖性，是子链与母链能准确配对的保

[1]以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;[2]需要模板和引物的存在;[3]不能起始合成新的DNA链;[4]催化dNTP加到生长中的DNA链的3‘-OH末端;[5]催化DNA合成的方向是5'→3'。

小结：DNA聚合酶的共同性质是:PutianUniversity2112级临本

[1]以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;三、DNA解螺旋酶、DNA拓扑异构酶单链DNA结合蛋白(1）解螺旋酶（helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。解链方向DnaBPutianUniversity2212级临本三、DNA解螺旋酶、DNA拓扑异构酶(1）解螺旋酶（hel（2）单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

单链DNA结合蛋白PutianUniversity2312级临本（2）单链DNA结合蛋白(singlestrandedD(3）DNA旋转酶(topoiSOmerase，又称拓扑异构酶)108局部解链后能改变DNA空间构型的酶，既具有水解、又能连接磷酸二酯键的特点。解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，均需DNA拓扑异构酶，改变DNA分子构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行。PutianUniversity2412级临本(3）DNA旋转酶(topoiSOmerase，又称拓扑异构类型拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ功能切断DNA双链中一股链，使DNA松弛后再封闭

切断DNA分子两股链，松弛后再封闭是否需要ATP不需ATP需要ATP拓扑异构酶的类型及功能4、引物酶(primase)引物酶是一种依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP)，能在DNA复制起始时催化合成一小段RNA作为引物(primer)

。PutianUniversity2512级临本类型拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ功能切断DNA双链中一股切DNA连接酶ATPADP作用方式：连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。四、DNA连接酶（DNAligase）DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：PutianUniversity2612级临本DNA连接酶ATPADP作用方式：连接DNA链3-OH末端TheProcessofDNAReplicationinProkaryotes第三节原核生物DNA复制过程PutianUniversity2712级临本TheProcessofDNAReplicatio原核生物、真核生物和病毒中DNA复制的过程基本相同，大致包含3个阶段：复制的起始、复制的延长、复制的终止。包括以下几个步骤：（1）模板DNA双链解开（2）RNA引物的合成（3）DNA链的延长（4）切除引物DNA复制的步骤（5）填补缺口（6）连接相邻DNA片段PutianUniversity2812级临本原核生物、真核生物和病毒中DNA复制的过程基一、复制的起始（一）、解旋解链，形成复制叉：解链：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。②

稳定单链：单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。PutianUniversity2912级临本一、复制的起始（一）、解旋解链，形成复制叉：解链：由拓扑异构在原核生物DNA复制的原点（OriC）富含A∶T序列，存在两个系列的重复单位：三个13bp构成的串联重复序列和四个9bp构成的反向重复序列。GATCTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATAA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列5

3

5

3

原核生物的DNA复制起点结构PutianUniversity3012级临本在原核生物DNA复制的原点（OriC）富含A∶T序列，存在PutianUniversity3112级临本PutianUniversity3112级临本

引发体是DNA复制起始时所形成的一种起始复合物，由引物酶和几种相关蛋白（如大肠杆菌的DnaA,DnaB,DnaC）及单链结合蛋白组成。

（二）、引发体的形成与引物的合成复制起始的主要任务是形成起始复合体(引发体)，合成引物。PutianUniversity3212级临本引发体是DNA复制起始时所形成的一种起始复合（二）、引发体DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

引发体(primosome)引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。PutianUniversity3312级临本DnaADnaB、DnaCDNA在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

3'HO5'3

5

3

5

引物引物酶合成引物PutianUniversity3412级临本在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从复制的延伸指在DNA聚合酶催化下，以3’→5’方向的亲代DNA链为模板，从5’→3’方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。二、DNA链的延伸5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPDNA-pol在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中是DNA聚合酶δ。PutianUniversity3512级临本复制的延伸指在DNA聚合酶催化下，以3’→5’方向的亲代DN原核生物DNApolⅢ催化前导链与随后链的合成PutianUniversity3612级临本原核生物DNApolⅢ催化前导链与随后链的合成Putian原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriterSV40500oriter

E.coli8232三、复制的终止PutianUniversity3712级临本原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(5`5`RNA酶5`OHP5`dNTPDNA聚合酶5`5`PDNA连接酶ATPADP+Pi5`5`三、复制的终止由RNA酶水解去除RNA引物；由DNA聚合酶Ⅰ催化延长缺口处的DNA，填补缺口。（1）去除引物，填补缺口：（2）连接冈崎片段：在缺口的最后一个磷酸酯键由DNA连接酶的催化生成，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。PutianUniversity3812级临本5`5`RNA酶5`OHP5`dNTPDNA聚合酶5`5`PDNA复制过程简图PutianUniversity3912级临本DNA复制过程简图PutianUniversity3912真核生物DNA生物合成过程TheProcessofDNABiosynthesisineukaryotes第四节PutianUniversity4012级临本真核生物DNA生物第四节PutianUniversit真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶

/

转换；切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAseHⅠ和FEN1等。RNAseHⅠ切除RNA引物，但在冈崎片段上保留一个核糖核苷酸,FEN1切除冈崎片段上保留的一个核糖核苷酸真核生物与原核生物DNA复制的差异：PutianUniversity4112级临本真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进真核生物与原核生复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。（一）真核生物复制的起始与原核基本相似增殖细胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）：在复制起始和延长中起关键作用。具有与E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在复制因子RFC的作用下PCNA结合于引物－模板链；并且PCNA使polδ获得持续合成能力。PutianUniversity4212级临本复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和（一）DNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-polδ通过PCNA的协同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3

-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由polα催化合成。然后由PCNA协同，polδ置换polα，继续合成DNA子链。（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶α/δ转换PutianUniversity4312级临本DNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。真核生物DNA复制的末端问题1、染色体DNA呈线状，复制在末端停止5`5`5`5`水解、聚合、连接5`5`5`5`

2、连接不连续片段PutianUniversity4412级临本真核生物DNA复制的末端问题1、染色体DNA呈线状，复制在末TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒（telomere）DNA及端粒酶端粒：真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。1、结构特点：1）由末端单链DNA序列和蛋白质构成2）末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。2、功能1）维持染色体的稳定性。2）保证染色体末端DNA复制的完整性。PutianUniversity4512级临本TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒（telomere）D端粒酶（telomerase）1、一种由RNA和蛋白质组成的复合物2、一种特殊的逆转录酶,能依赖自身的RNA为模板逆转录合成端粒DNA特点：功能：染色体线性DNA复制终止时，末端有可能缩短，但通过端粒酶的作用，可以补偿这种由于去除引物而引起的末端缩短。以自身RNA为膜板逆转录合成端粒DNA。端粒酶：负责端粒延长的一种酶。PutianUniversity4612级临本端粒酶（telomerase）1、一种由RNA和蛋白质组成的端粒酶的爬行模型（动画演示）PutianUniversity4712级临本端粒酶的爬行模型（动画演示）Putian