组织培养技术

第五章组织培养技术第一节植物组织培养所谓植物组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义上是指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也包括在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植株。一、概述（一）概念1植物组织培养：是指通过无菌操作，把植物的外植体接种于人工配置的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其成为完整植株的方法。2外植体：是指用于植物组织培养的接种材料，它包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。3愈伤组（Callu原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。（二）组织培养类型1养养3养培养；.；；.；史是0。过阶；2家t。9年e，t与t。罗士韦是我国植物组织和细胞培养研究的开拓者和奠基人之一（四）植物组织培养的应用⒈植物的快速繁殖：⑴园艺、花卉植物的大规模快速繁殖；⑵抢救濒危珍稀植物⑶进行某些植物的种质资源保存⒉培育无病毒的植物，如脱病毒草莓等；⒊制造人工种子。4突变体的筛选培育5药用植物的工厂化生产6花药培养和花粉单倍体育种7基因工程的应用等二、实验室设计和设备（一）实验室设计 一般具有：1.准备室器皿洗涤，培养基配制、分装、高压灭菌，植物材料的预处理，重蒸馏水的制备以及进行生理、生化因素的分析等各种操作都要在此室中进行.2.缓冲室进入无菌室前需在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。最好安装1盏紫外灯，用以灭菌。3.无菌操作室也称接种室。主要有超净工作台、空调机、医用小平车等4.培养室具备适宜的温度湿度光照通风等条件有培养架子和灯光；通风设施；边台；5.驯化室和温室（二）常用设备1．超净工作台2.无菌箱3．空调机4．除湿机5．恒温箱又称培养箱6．烘箱7．高压灭菌器8．冰箱9．天平10．显微镜11．摇床或转床12．酸度计等（三）器皿用具1培养器皿器皿按材料分有玻璃器皿与塑料器皿两种按其形状分主要有试管、三角瓶、圆形培养瓶和培养皿L型管和T型管等2、分注器3、离心管4、移液管5、细菌过滤器6、器械用具：镊子、剪刀、接种工具、大解剖刀等7、实验器皿三、培养基及其配制（一）培养基的种类：1.根据态相不同分为：固体培养基与液体培养基2.根据培养过程分为：初代培养基与继代培养基。3.作用不同分为：诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。4.根据营养水平不同分为基本培养基和完全培养基基本培养基主要有MS、WhitB5N6良SrhierH基质。分 ：1素2、维生素类：B族维生素，如硫胺素（维生素B1、吡哆醇（维生素B6、烟酸（维生素B3，又称维生素PP）和泛酸钙（维生素B5、叶酸（维生素Bc、抗坏血酸（维生素C）等3酰（如天门冬酰胺和多种氨基酸的混合）等4，5：6哚（A（A（A-酸)哚（A（A（T-（A、（T。7碳（三）培养基配制1水和药品的准备：2器皿和用具的准备：不同型号的烧杯、容量瓶、移液管、滴管、玻璃棒、三角瓶、试管、培养瓶、培养基分装器等3.母液的配制和保存：经常使用的培养基，可先将各种药品配成浓缩一定倍数的母液放入冰箱内保存用时再按比例稀释一般配成大量元素微量元素、铁盐、维生素、氨基酸等母液；生长调节物质也可分别配制成溶液，储存于冰箱（1）配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。分别称取NH4NO3165、KH2PO417、KNO3190、CaCl2·2H2O44、MgSO4·7H2O37g各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。（2）配制MS微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取KI0.083g、Na2MoO·2H2O0.025、H3BO30.62、MnSO4·H2O1.69、CuSO4·5H2O0.0025、CoCl6H2O0.0025ZnSO47H2O0.86g配成1L入L放。4·O和2·O由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一可先配成调整液即先分别称取CuSO45H2O0.05gCoCl26H2O0.05g、各自配成100mL的调整液，然后取5mL就还有0.0025g的量。（3）配制MS有机母液一般配制成100倍MS有机母液依次称取肌醇10g盐酸硫胺（VB10.01、烟酸0.05酸g（6g成L入L剂。（4制S液成0倍S取A钠g、4·g成L入L。（5制先量%或1的H用1溶取g成L。.培养基的配制及其灭菌：应当注意的是，某些生长调节物质如IA、T、A行毒点S基盐富e基：低6基是K3和（N4）24。4.B5培养基：特点是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。四、植物组织培养基本操作和培养技术（一）玻璃器皿清洗（二）培养基配制（三）外植体的选择和灭菌操作技术基本要点：一是要创造无菌的条件；二是要在无菌的适当条件下培育植物材料，这就必须注意材料的选择、培养基的组成、激素的应用、培养方法和培养条件等等。1.选择优良种质、健壮的植株、选择最适时期、选取适宜大小2.外植体的灭菌：外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取预处理是，先对植物组织进行修整，去掉不需要部分，在流水中冲洗干净。经过预处理植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。常用灭菌剂使用浓度及效果比较表灭菌剂名称 使用浓% 消毒难易 灭菌时间 灭菌效果酒精 7～75 易 0.～3 好氯化汞 0.～0.2 较难 2～10 最好漂白粉 饱和溶液 易 5～30 很好次氯酸钙 9～10 易 5～30 很好次氯酸钠 2（活性氧） 易 5～30 很好过氧化氢 1～12 最易 5～15 好抗菌素 4～50mg/L 中 3～60 较好（五）无菌培养（接种后的外植体应送到培养室去培养）1培养条件最主要的是光照、温度、湿度、氧气等。光照普通要求每日光照12～16，光强1000l～5000lx；温度大多数植物最适温度在23C～32C之间。一般所用的温度是25C±2C。低于1C或高于35C，对生长都是不利；湿度一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100。二是培养室的湿度。要求室内保持70%～80%的相对湿度。※愈伤组织在培养基上生长一段时间后由于营养物质枯竭水分散失以及积累一些组织代谢产物，因此必须将组织转移到新培养基上。这种转移过程称为继代或称传代。一般在25C～28C下进行固体培养时，每隔4～6周进行一次继代培养。（六）定期检查和观察在培养中易出现下列现象：1.出现污染现象2.外植体的褐化现象3.培养物的玻璃化现象※菌类污染、褐化和玻璃化称为植物组织培养的3大难题1.污染的原因:从病源菌方面,主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。2、污染的预防措施:※防止材料带菌的措（1用茎尖作外植体时可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养（2）避免阴雨天在田间采取外植体3）目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法※外植体的灭菌（1）多次灭菌法2）多种药液交替浸泡法※器皿与金属器械的灭菌；※布质制品的灭菌；※无菌操作室的灭菌；※操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行。外植体的褐变及其预防措施1原因褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。2、影响褐变的因素随着植物种类基因型外植体的部位及生理状况等的不同褐变的程度也有所不同。3、褐变的预防措施：选择适宜的外植体；采用适宜的培养基和光温条件；在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂；缩短转瓶周期；培养物的玻璃化现象及其预防措施1、什么叫玻璃化现象？与正常苗有显著差:其叶嫩梢呈水晶透明或半透明植株矮小肿胀失绿叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。2、玻璃化的原因：激素浓度；琼脂浓度；温度；光照时间；通风条件；离子水平；3、预防玻璃化的措施：适当控制培养基中无机营养成分；适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度；适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度增加自然光照控制光照时间度改质；栽.点境:；第1第2，第3气第4弱。.化，高率。.栽：节 养、点壁慢感成养0化性，a胞悬浮生长型细胞：如血液白细胞，淋巴组织细胞等三、体外培养特点营养条件苛刻适应性差,敏感培养时间长，易污染四、体外培养条件温度，37度pH：7.2-7.4气体：氧，二氧化碳，氮气营养条件：需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供五、体外细胞生长增殖过程原代培养期；传代培养期；衰退期六、设备、试剂及培养基的选择和配制1.设备包括培养箱(特别是二氧化碳培养箱)、无菌室或者超净工作台、光学显微镜特别是倒置显微镜各种规格的培养瓶(包括无钾玻璃的或无毒塑料的封闭式的或螺口式的等)2.常用试剂有抗生素贴壁因子生长因子还需要激素凝集素脂多糖(LPS)、各种营养剂胰酶、胶原酶、EDTA、各种生物缓冲剂等3.培养基的选择和配制培养基由三部分组成：基础培养基、血清和基质。自行配制或用现成的化学合成培养基常用的化学合成培养基有Eagle(包括BME、MEMDME等)F10F1199RPMI1640EBSHBSSMcCoy‘s5aFshe’s、BGb、Swi‘sS77等；培养中血的度范为5％～20％，以10％浓度最为用；维某些胞在外生机增殖，需要先培养中添加纤黏、昆氨、白胶之的壁因。一般用水粉配培养基，过滤和集；七、培养方法悬滴；旋转管；灌注小室；培养瓶；培养板八、组织培养的污染、检测和排除1.污染的主要途径和媒介的发生空气、清洗消毒、操作、血清、组织2.组织细胞污染的检测真菌污染细菌污染支原体污染3.组织细胞污染的排除抗生素除菌法、加温除菌法、动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法九、细胞培养物在液氮中的保存和复苏(一)培养物在液氮中的保存二)冻存细胞的复苏三)细胞培养物冻存和复苏中的安全措施十、动物组织培养的一些新应用(一)组织工程组织工程用于重建组织和器官，强化组织和器官的功能。(二)毒理学研究细胞培养技术可用来作为毒理学试验的重要手段。(三)骨溶解病变过程的观察(四)细胞衰老的研究(五)神经细胞保护的研究十一克隆技术及其应用根据克隆的层次分为基因克隆、细胞克隆、组织克隆、器官克隆及完整的生物体克隆。(1基因克隆是指通过分子重组技术或是扩（如PCR扩增DNA片断的相同序列的大量拷贝，它是深入研究基因的结构、转化、表达、调控及进行基因改造的基础。常用的目的基因克隆技术包括：①通过已知基因产物的分析和鉴定，进一步确定氨基酸顺序后推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR引物来分离目的基因。②通过遗传表型分析的基因克隆，首先通过物理、化学或是生物的方法引起某一基因失活或过量表达，产生一些突变体，然后找出突变体文库和野生型文库中的差异，分离目的基因。③以图谱为基础的定位克隆技术，该技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。随着基因组测序及生物信息学的快速发展，还有根据同源序列进行克隆，使电子PCR进行克隆及使用DNA芯片技术进行新基因筛选和克隆等许多新的方法，使基因克隆的效率不断提高。(2)细胞克隆组织克隆和器官克隆是克隆技术在细胞水平组织水平和器官水平上的应用，可用来生产大量相同的细胞、组织和器官。细胞克隆技术在制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术中运用较多。(2)动物克隆。①科学家选取了三只母羊，通过显微操作先将一只母羊的卵细胞