细菌DNA提取方案

细菌DNA提取方案：革兰氏阴性菌，如E.coli,一般有三种可以选择的方法。一、 水煮模板法一一主要用于PCR反应1、 接种单菌落于LB或脑心平板，连续画线，37摄氏度培养18—24小时。2、 刮取1〜2接种环菌苔加入150微升三蒸水中，混匀，100摄氏度煮沸10分钟。3、 12000转/分钟离心10分钟，取上清，一20摄氏度保存备用。操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。编者建议：此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一次。二、 CTAB/NaCl法1、 接种一单菌落于5mlLB中,30°C培养过夜，2、 取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37C、220r/min培养16小时；3、 5000r/min离心10分钟，弃去上清。4、 加入10mlTE离心洗涤后，用10mlTE溶解菌体,混匀广20C保存备用。5、 取3.5ml菌悬液，加入18知110%SDS，混匀，加入37pl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37C温育1小时6、 加入740p15mo1/LNaC1,再加入512p1CTAB/NaC1,混匀,65C温育10分钟。7、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀,10000r/min离心5分钟，保留上清。8、上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1),混匀,10000r/min离心5分钟，保留上清。9、 加入0.6倍的异丙醇，混匀,10000r/min离心5分钟，收集DNA沉淀，用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。10、 用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20pg/mlRNaseA,4°C保存。CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20pg/mlRnaseA加在第5步温育的时候，这样最后没有RnaseA污染。每一步操作细致一些，得到的DNA可用于Southernblot。编者建议：长时间保存DNA可放于-20C，但要尽量减少反复冻融，否则影响DNA质量。三、盐析法1、 1.5ml对数期菌液2、 12000rpm30s3、 200ul裂解液(同CTAB/NaCl法)，37c,1hr4、 66ul5MNaCL,混匀充分，12000rpm10min5、 上清用粗枪头取至新管6、 等体积酚充分混匀，12000rpm3min，反复抽提至无蛋白层7、 取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm3min8、 上清至新管，2倍体积预冷无水乙醇9、 -20C，20min，14000rpm，15min10、400ul70%冷乙醇洗涤11、干燥，100ul20ug/mlRNaseA,37C,30min12、 2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤13、 干燥，溶于100ulTE介于方法一和方法二之间，CTAB虽然取出糖分效果较好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放弃了CTAB。革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶，37度温育1h。实验注意：提基因组最好要将枪