胰岛素样生长因子i受体抑制剂osi-906体外抗细粒棘球绦虫原头作用研究

胰岛素样生长因子i受体抑制剂osi-906体外抗细粒棘球绦虫原头作用研究

cyheecec症也被称为cyheec症。这是一种古老的人兽共同病，已经成为世界公共卫生的一个重要问题。包虫病主要有4种,其中95%为细粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus,Eg)感染所致的囊型包虫病(cystisechinococcosis,CE)。CE呈世界性分布,我国是CE高发国之一。手术切除病灶为包虫病临床治疗的主要手段,但是当囊肿较大或者靠近肝门等血管时容易发生原头节外溢,造成术后复发,因此术前或术后药物辅助治疗就尤为重要。然而经典药物阿苯达唑片剂或脂质体药物因肠道吸收差,血药、肝药浓度较低等缺陷而疗效欠佳。因此,寻找新的抗CE药物具有重要意义。OSI-906是OSI药物公司研发的一种胰岛素样生长因子-1受体(IGF-ⅠR)抑制剂,目前正作为一种抗癌剂进行Ⅰ期临床实验。该化合物可高度选择并且有效抑制配体依赖的IGF-ⅠR和ⅠR的自身磷酸化,继而抑制下游信号通路成员(如AKT、ERK1/2)的激活从而抑制肿瘤细胞的生长。Zheng等发现细粒棘球绦虫中存在胰岛素信号通路成员,但尚不清楚OSI-906等胰岛素信号通路受体抑制剂是否具有抗包虫作用。本研究用不同浓度的IGF-ⅠR抑制剂OSI-906体外干预细粒棘球绦虫原头蚴,观察OSI-906对其生长的影响,以期用于CE的治疗。材料和方法1材料表面1.1样品1.2dmso和伊红OSI-906购自上海瀚香生物科技有限公司,批号:2014022808;DMSO购自美国Sigma公司;伊红购自美国Amresco公司;胎牛血清,青链霉素和RDMI1640细胞培养基均购自美国GIBCO公司。1.3涡流振荡仪和ms3cdsa3-meloCO2恒温细胞培养箱购自美国Thermo公司;JA1203型电子天平购自德国赛多利斯股份公司;MS3digital涡旋振荡仪购自德国IKA公司;DMI4000B倒置荧光显微镜、LKB-Nova型超薄切片机均购自德国Leical公司;JEM-1230透射电子显微镜购自日本JEOL公司。2方法2.1原65%以上拒染物的测定用75%酒精消毒感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏表面,无菌条件下抽取肝包囊内囊液并移入无菌瓶中,待原头节自然下沉后弃去上清,用PBS(pH7.2)清洗头节3~5次,用伊红染色法检测原蚴95%以上拒染。将原头节加入细胞培养基(RDMI1640︰胎牛血清︰青、链霉素=89︰10︰1)中于37℃、5%CO2恒温培养箱培养。2.3原头节和空白组、溶剂组pbs液、空白组选择OSI-906100、25和3.125μmol/L浓度组作用4d的原头节以及空白组、溶剂组的原头节,PBS液清洗3次,每次5min;用4%戊二醛固定24h,1%锇酸固定1h,经丙酮酸梯度脱水、EPON812包埋后切片,于铜网上用醋酸铀、柠檬酸铅双重染色,透射电镜观察其超微结构变化并拍照记录。2.4统计分析应用SPSS18.0统计软件,采用计量资料随机区组方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1增加原头节钙颗粒OSI-906体外作用1d后,倒置荧光显微镜下观察OSI-906各浓度组细粒棘球蚴头节顶突部分外凸,其中高浓度组(100μmol/L)可见虫体团缩。2d后高浓度组原头节钙颗粒明显减少,其体积更小。4d后空白对照组和DMSO组头节呈内陷型,虫体体积较大,偶可见原头节伸缩活动(图1A和图1B),伊红染色均不着色,OSI-906低浓度(50μmol/L)组大部分原头节着色(图1C),高浓度组虫体严重固缩,体积明显缩小,部分虫体发生解离,未解离虫体伊红染色均着色(图1D)。2空白对照组osi-906不同作用时间原头存活率根据虫体计数计算原头节活力,结果见图2。其中培养第1d空白对照组和DMSO组活力分别为(92.52±1.36)%和(91.87±1.86)%。1d后各用药组原头节活力均显著下降,其中100和50μmol/L组不同作用时间原头蚴存活率与空白对照组和溶剂组(DMSO)相比差异均有统计学意义(F=3.586,P<0.05);其余浓度组间比较原头蚴存活率差异无统计学意义(F=1.953,P>0.05)。培养至第3d时100μmol/L的OSI-906组原头节存活率为(42.38±1.05)%,至第4d时OSI-906100μmol/L组原头节均死亡,25μmol/L组原头蚴存活率为39.17%,空白对照组原头蚴存活率为87.91%,差异有统计学意义(F=5.861,P<0.05)。OSI-906对细粒棘球绦虫原头蚴半数致死浓度(LC50)为26.55μmol/L。3干预材料的确定透过电镜观察正常原头节(图3A)和DMSO组原头节(图3B)角质层及生发层结构清晰可辨,细胞规整,微毛排列整齐,皮层细胞核大且圆,核仁清晰,肌纤维细胞束结构清晰可辨;OSI-90625μmol/L浓度组干预4d的原头节角质层变薄、消失,微毛消失,皮层区变薄,出现大小不等的空泡,细胞极少,核形不规则,核内异染色质增多,呈粗大团块状边集(图3C)。OSI-906100μmol/L浓度组干预4d的原头节角质层与生发层纹理严重破坏,皮层区微毛完全消失,细胞崩解,核膜破损,核仁散开,呈现团缩凋亡征象,偶可见破碎的裸核细胞(图3D)。osi-906抑制其他配体的诱导表达OSI-906是OSIPharmaceuticals公司在先导化合物的基础上,通过混合基础结构设计的咪唑并吡嗪类化合物(属于一类新颖的小分子IGF-ⅠR抑制剂),其抗肿瘤功效十分显著。目前,OSI-906已用于局部晚期或转移性肾上腺皮质癌的临床Ⅲ期试验,同时与紫衫醇联合应用于复发性上皮性卵巢癌的临床I/Ⅱ期试验。研究发现细粒棘球绦虫中存在胰岛素信号通路成员,那么开展对该信号通路抑制剂的相关研究就有了更重要和可靠的理论依据。作为一种多细胞生物,细粒棘球蚴也通过胰岛素信号转导通路来调节细胞的生长与分化。其下游的ERK信号通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路,参与细胞生长、分化、凋亡等多种生物活性的调节,是细胞内重要信号的传递者,因此该通路成为多种疾病研究的重点。对肿瘤的相关研究发现,OSI-906抑制肿瘤的生长主要通过高效抑制配体依赖的IGF-ⅠR和ⅠR自身磷酸化从而破坏配体诱导的下游通路AKT和(或)ERK1/2的激活,最终抑制肿瘤的增殖与扩散。Fox等发现OSI-906通过阻断MAPK和PI3K/Akt两条通路选择性抑制IGF-ⅠR的自身磷酸化从而抑制乳腺癌细胞的生长。鉴于IGF-ⅠR抑制剂对多种肿瘤的良好治疗效果,本研究选择OSI-906进行体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用观察,结果显示OSI-906100μmol/L和50μmol/L组不同作用时间原头蚴存活率与空白对照组和溶剂组(DMSO)相比差异均有统计学意义(P<0.05)。作用第4d后OSI-906高剂量组(100μmol/L)原头节全部死亡,抗原头节作用显著。本实验观察到OSI-906干预后的原头节超微结构和类型与文献[9,10]报道的原头蚴超微结构基本一致,但高尔基体、内质网、核糖体等细胞器少见,这可能与OSI-906抑制配体依赖的IGF-ⅠR和ⅠR自身磷酸化破坏了配体诱导的下游通路AKT和(或)ERK1/2的激活最终导致糖原获取失败有关,但尚无充分证据证实,有待继续研究。感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏取自新疆华凌屠宰场。2.2药物干预对osi-906浓度的影响细粒棘球蚴原头节培养3~5d后,进行药物干预。将含有原头节的培养液加入到96孔板中,每孔约200个原头节。实验共设8个组,每组平行做3份,分别为:空白对照组(加入200μlRDMI