高温蒸汽施工工艺对玛咖块根黑芥子酶的影响

高温蒸汽施工工艺对玛咖块根黑芥子酶的影响

0工艺方法对玛咖黑规子酶的影响[研究意义]meyeniiwalp是一种原产于秘鲁海拔3500米以上的汉江山脉草本植物。属于十字花科的一种独立蔬菜。它的种植和食用历史悠久，具有抗疲劳、改善功能、提高生育等功效。芥子油苷及其多种代谢物质被认为是玛咖保健功效的主要活性物质,苄基芥子油苷和苄基异硫氰酸酯被开发为睾丸酮增强剂,能改善学习记忆和男性的性能力,已申请日本专利,另据报道还具有抗癌、抗氧化及抗菌等作用,因此在贮藏与加工中,尽可能保留更多有益的芥子油苷具有重要意义。【前人研究进展】玛咖等十字花科植物中存在一种特有的底物-酶系统:芥子油苷-黑芥子酶系统,其中的芥子油苷在组织细胞损伤时会直接接触黑芥子酶而被大量分解,有必要在贮藏和加工之前对新采收玛咖原料中的黑芥子酶立即进行钝化处理,以最大限度保留其中的芥子油苷。常见的酶钝化处理方式主要有热水烫漂、蒸汽烫漂、微波烫漂等,高温短时蒸汽烫漂(hightemperature-shorttimesteamblanching,HTSTSB)利用蒸汽进行烫漂,是一种新兴的烫漂方式,其工艺利用蒸汽的潜热,热效率高,节能效果显著,可用于玛咖黑芥子酶的钝化工艺中,达到更迅速、高效的钝酶效果,保持产品品质。甘瑾等研究发现,在鲜玛咖自然干燥以及真空干燥过程中,芥子油苷均存在不同程度的分解,尤其以切片后真空干燥的损失率较大,认为是玛咖块根加工时组织受到损伤,黑芥子酶与芥子油苷接触而导致其大量分解,因此建议加工处理前首先对黑芥子酶进行钝化处理以有效保留玛咖中的芥子油苷含量。金闻文检测玛咖干根中芥子油苷的含量达到1.92%,商业化玛咖干粉中芥子油苷的含量为0.13%,上述差别可能来自玛咖产品贮藏及加工过程中黑芥子酶使芥子油苷成分分解。采用热水烫漂玛咖块根,会导致物料中的功效活性成分如可溶性蛋白、生物碱、芥子油苷和总酚等向热水扩散大量溶失。HTSTSB以高温水蒸汽作为加热介质对果蔬进行烫漂,与热水烫漂相比,钝化时间较短,对组织细胞破坏较小,并可减少水溶性营养成分损失,黄俊丽等将HTSTSB法用于黑牛肝菌过氧化物酶和多酚氧化酶的钝化,Yu等将其用于马铃薯过氧化物酶的钝化,都取得了较好的效果。【本研究切入点】目前直接以新采收的玛咖块根为原料,将HTSTSB技术应用于钝化黑芥子酶的钝化未见报道。单因素试验结果可以确定较佳的工艺优化水平,响应面分析法(RSM)将各因素与指标间的相互关系近似拟合成多项式,并以此对函数的响应面和等值线进行分析,可通过较少试验次数找到最优工艺条件,且优化的工艺科学性强、可信度高、重现性好。同时不同灭酶方式各有优缺点,灭酶的效果及灭酶后玛咖块根的品质存在差异。【拟解决的关键问题】本试验将RSM应用于HTSTSB钝化玛咖块根黑芥子酶活性的工艺中,以期优化得到HTSTSB技术处理玛咖的最佳工艺参数,在降低玛咖黑芥子酶活性的同时,尽可能多地保留玛咖中的芥子油苷及其它营养成分,为后续加工出高品质玛咖产品提供必要条件。1材料和方法1.1试验材料及设备供试冰鲜玛咖,由中国林业科学院资源昆虫研究所滇中高原试验站提供(LepidiummeyeniiWalp.表皮黄色),试验于2012年2月在国家林业局特色森林资源工程技术研究中心进行。黑芥子硫苷酸钾(sinigrin)购于Sigma公司,纯度≥99.0%;盐酸小檗碱,阿拉丁化学试剂(上海)有限公司;甲醇、乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、溴麝香草酚蓝、氯仿、无水氯化钙(均为分析纯)购于西陇化工股份有限公司。1.2仪器、试药和仪器HX-7.5D型电加热蒸汽发生器,上海华征特种锅炉有限公司;MAS-I型常压微波萃取仪,上海新仪微波化学科技有限公司;MM400型冷冻混合球磨仪,德国Retsch公司;DU800型紫外-可见光分光光度计,美国贝克曼库尔特有限公司;AB204-S精密型电子天平、HR83-P型快速卤素水分测定仪,MettlerToledo中国有限公司;TY742X2A纯水机,美国Barnstead公司;Z323K通用型高速冷冻离心机,德国Hermie公司;HH-6型数显恒温水浴锅,常州澳华科技有限公司;Epsilon1-4中试型冻干机,德国Christ公司;10—1000µL手动可调量程单道移液器,德国Eppendorf公司。1.3测试方法1.3.1不同蒸汽压力下玛咖块根黑规子酶活性的比较HTSTSB钝化玛咖块根黑芥子酶活性以蒸汽作为介质进行处理,而蒸汽的压力对应的相应温度,不同蒸汽压力、蒸汽处理时间以及载料量对黑芥子酶活性及芥子油苷的分解均有不同程度的影响。根据芥子苷的熔点确定蒸汽压力控制在0.5MPa以下较为合适;根据课题组预试验结果,0.3MPa的蒸汽压力下处理60s已能较好钝化黑芥子酶活性,为符合烫漂高温短时的要求,控制蒸汽处理时间在70s以下,载料量由设备容积及预试验的结果控制在500g以下。从-5℃冰箱取出的玛咖块根,筛选大小一致(直径约15cm)、无病虫害的个体放置于4℃冰箱恒温3h,后取出并按试验设计要求,精确称取一定质量的原料,放入高温蒸汽钝酶处理器中,当蒸汽压力达到设定值,迅速打开蒸汽出口开关,将蒸汽通入盛有原料的处理器中,处理结束后关闭蒸汽出口开关,放气,用秒表记录处理时间。取出原料后用保鲜袋装好编号,置于流水中冷却5min。然后测定其黑芥子酶活性及芥子油苷含量。每个样品进行3次平行试验。1.3.1.不同蒸汽压力对玛咖块根黑底物的影响称取玛咖块根300g,控制蒸汽压力分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5MPa对玛咖块根处理50s,考察不同蒸汽压力对玛咖块根黑芥子酶活性及芥子油苷含量的影响。1.3.1.不同蒸汽时间对玛咖块根黑底物的影响称取玛咖块根300g,控制蒸汽压力为0.3MPa,对玛咖块根分别处理30、40、50、60、70s,考察不同蒸汽时间对玛咖块根黑芥子酶活性及芥子油苷含量的影响。1.3.1.不同载料量对玛咖黑采用单因素实验的影响在蒸汽压力为0.3MPa时,在载料量分别为100、200、300、400、500g条件下对玛咖进行高温蒸汽处理50s,考察不同载料量对玛咖黑芥子酶活性及芥子油苷含量的影响。1.3.2玛咖块根黑槲子酶活性试验设计在单因素试验基础上,利用Design-expert7.1.3软件,按Box-BehnkenDesign(BBD)原理进行试验设计,以影响黑芥子酶活性的3个主要因素蒸汽压力、蒸汽时间和载料量为响应变量(分别用A、B和C来表示),玛咖块根黑芥子酶活性Y1及芥子油苷含量Y2为响应值进行响应面优化,试验因素水平设计见表1。1.3.3不同处理方式样品的黑越界酶活性比较将HTSTSB最优工艺条件下的玛咖块根与热水烫漂、微波烫漂处理以及未经处理的鲜玛咖的品质进行对比分析。各取3份50g样品进行不同方式处理,热水烫漂条件为在300mL沸水中处理150s;微波烫漂的条件为在700W功率下处理60s。各样品处理结束后取出放入保鲜袋装好,置于流水中冷却5min,然后测定其黑芥子酶相对酶活性及品质指标。根据对速冻果蔬残余酶活性的公认参考值要求,确定残余酶活性低于5%为烫漂终点,以获得良好的玛咖品质。1.4玛咖块根可溶性蛋白、总酚含量测定黑芥子酶活性的测定:参照张蕾等的方法测定;芥子油苷含量测定:氯化钯法测定;生物碱含量测定:酸性染料比色法测定;可溶性蛋白含量:考马斯亮蓝法测定;总酚的测定参照Pirie等的方法并作适当修改:2g玛咖块根组织用20mL预冷的1%盐酸甲醇溶液充分研磨提取,于4℃12000r/min离心10min,上清液用紫外分光光度计于280nm处比色测量吸光值,总酚含量以1U=OD280·g-1Fw表示。以上样品均平行测定3次。2结果2.1htstb对马草酸黑芥菜酶活性和芥末含量的影响2.1.1蒸汽压力对玛咖黑合素的影响蒸汽压力对玛咖块根黑芥子酶活性和芥子油苷含量的影响如图1所示。从图1可以看出,玛咖块根黑芥子酶活性随蒸汽压力的增加而快速降低,芥子油苷的含量也逐渐下降。当蒸汽压力为0.5MPa时,玛咖黑芥子酶活性几乎完全丧失,此时芥子油苷含量为1.04%,而试验试料玛咖块根的初始芥子油苷含量为1.31%,损失率为24.4%。这说明玛咖黑芥子酶在高温蒸汽处理条件下很容易失活,但较大的蒸汽压力对应着较高的蒸汽温度,使玛咖块根产生了一些不良异味,且使芥子油苷含量也进一步减少,造成玛咖营养品质及外观品质受损严重,所以选择蒸汽压力0.3MPa左右为优化水平。2.1.2蒸汽处理时间对玛咖黑合物回收的影响蒸汽时间对玛咖块根黑芥子酶活性和芥子油苷含量的影响如图2所示。由图2可知,玛咖黑芥子酶活性随蒸汽时间的延长,黑芥子酶活性下降明显,随着蒸汽处理时间的延长,累积的热量也逐渐增加,从而导致玛咖块根中芥子油苷逐渐被分解。若蒸汽处理时间较短,达不到钝化酶的效果,处理时间过长,虽然能完全钝化黑芥子酶,但芥子油苷以及营养成分可能会大量损失,如当蒸汽时间为70s时,玛咖黑芥子残余酶活性为0.63%,芥子油苷含量下降到0.85%。因此选择时间的优化水平为40—60s较为合适。2.1.3载料量的影响载料量对玛咖块根黑芥子酶活性和芥子油苷含量的影响如图3所示。由图3可知,在蒸汽压力和蒸汽处理时间一定的条件下,随着载料量的增加,玛咖块根中黑芥子酶活性逐渐上升,这可能是物料与高温蒸汽接触面积减小有关,同时芥子油苷含量也逐渐增大。当载料量超过300g时,玛咖块根黑芥子酶活性上升较为迅速,芥子油苷含量也有一定程度的上升;载料量低于200g时,黑芥子酶活性下降较缓慢,且芥子油苷含量下降较明显。因此选择时间的优化水平为200—300g较为合适。2.2htstb黑加工酶活性参数响应面优化2.2.1回归方程的建立及显著性分析结合单因素试验的结果及分析,按BBD试验方案进行三因素三水平试验,所得结果见表2。将所得的试验数据进行多元回归拟合,得到以玛咖黑芥子酶活性及芥子油苷含量为目标函数的二次多项回归方程。由表3可知,得到的两个数学拟合模型的R2值分别为0.9868和0.9643,其数值均接近1,可见通过多元二次回归得到的Y1和Y2的模型与试验拟合很好,具有较高的可靠性,可用于分析和预测高温短时蒸汽处理玛咖块根的工艺结果。根据Y1和Y2模型的方差分析结果,可知玛咖黑芥子酶活性及芥子油苷含量建立的回归模型均为极显著(P<0.0001)。为检验方程的有效性,对上述回归模型进行方差分析(表4)。结果表明,2个回归模型失拟项的P值均大于0.05,说明失拟项差异不显著,同时两个回归模型均极显著(P<0.0001),表明黑芥子酶活性及芥子油苷含量的实测值与预测值之间具有较好的拟合度,因此所得的回归方程能较好地预测玛咖黑芥子酶活性及芥子油苷含量与各因素之间的变化关系。从表4回归方程系数检验的P值可以看出,各因素的改变对响应值的影响不是简单的线性关系,而是存在交互作用的影响。对于黑芥子酶活性,一次项A、B极显著,C显著;交互项AB、AC均不显著,BC显著;二次型A2、B2均显著,C2不显著;对于芥子油苷含量,A、B极显著,C显著;交互项AB显著,AC、BC均不显著;二次型A2、B2均不显著,C2显著。结合F值的大小,可知影响玛咖黑芥子酶活性及芥子油苷含量的主效应关系均为蒸汽压力>蒸汽时间>载料量。2.2.2不同蒸汽处理对玛咖块根黑规子酶活性的影响根据回归方程作出模型的响应曲面及等高线见图4—6,通过该组图可以比较直观地反映任何两因素的交互影响,以及各因素对玛咖块根黑芥子酶活性及芥子油苷含量的影响。由图4—图6可知,各因素中以蒸汽压力对玛咖黑芥子酶活性影响最大,其次是蒸汽处理时间,载料量的影响最小。蒸汽压力和蒸汽处理时间对玛咖块根黑芥子酶活性有非常明显的交互影响作用,即玛咖黑芥子酶活性在高蒸汽压力,长时间处理下降低显著,如在蒸汽压力为0.4MPa时,处理60s,黑芥子酶活性几乎完全丧失。因此适当提高蒸汽压力及延长蒸汽处理时间可以有效控制玛咖块根黑芥子酶活性。图4—图6比较直观地预测了高温蒸汽处理时各个因素对玛咖块根中芥子油苷含量的影响。各因素中以蒸汽压力对HTSTSB处理过程中玛咖块根中芥子油苷含量的保留影响最大,其次是蒸汽处理时间及载料量。这是因为玛咖块根芥子油苷对温度的敏感程度较高,在高温下容易发生分解,同时各因素之间存在一定的交互影响。2.3玛咖块根的蒸汽热处理响应面模型预测的黑马克思主义子酶活性对所得数据进行分析,优化参数选择黑芥子酶活性及芥子油苷含量重要性均为5,黑芥子酶活性目标为0—5的最小值响应,芥子油苷含量目标为0.81—1.36的最大值响应,预测出玛咖块根高温蒸汽热处理工艺条件为:蒸汽压力0.35MPa,蒸汽处理时间为51.37s,载料量为243.38g,在此条件下响应面模型预测的玛咖块根黑芥子酶活性为1.89%,芥子油苷含量为0.95%。在该条件下,调整蒸汽压力为0.35MPa、蒸汽处理时间50s,载料量240g,进行3次验证试验,实际测得的玛咖黑芥子酶平均酶活性为1.96%,芥子油苷含量为0.98%,与模型预测值均相差不大,说明该方程与实际情况拟合良好,证明用响应曲面法预测高压蒸汽处理对玛咖块根黑芥子酶活性及芥子油苷含量的影响是可行的。2.4微波处理对玛咖黑帐篷的影响不同热处理方式对玛咖块根品质均有一定的影响,玛咖经处理后分别测定了黑芥子酶活性、芥子油苷含量、生物碱含量、蛋白质含量以及总酚含量,结果详见表5。可以看出,玛咖块根热水烫漂需要150s才能达到烫漂终点要求,此时玛咖黑芥子酶活性降低到3.86%,但玛咖中重要次生代谢产物芥子油苷含量也降低到0.71%,同时生物碱、总酚以及蛋白质含量均有不同程度的下降,营养成分损失较多;微波处理时间较短,但微波处理时微波场温度分布不均匀现象十分明显,导致玛咖块根表面出现了焦化及褐变现象,进而影响了微波钝化黑芥子酶的效果,同时蛋白质含量及总酚含量下降也较明显。而在HTSTSB最佳工艺条件下处理,玛咖中剩余黑芥子酶活性仅为1.96%,芥子油苷含量为0.98%,生物碱含量为0.35%,蛋白质含量为10.73%,总酚含量为0.75OD280·g-1FW,均高于传统热水烫漂法。3讨论3.1热水温度对红树莓原汁活性的影响不同蒸汽压力对应着不同的温度,0.1、0.2、0.3、0.4和0.5MPa的蒸汽压力对应的蒸汽温度分别为100、120、133、144和151℃。阮思煜等研究表明,温度对黑芥子酶活性影响极显著,其失活动力学模型符合一级反应,在经100℃热水处理30min,红心萝卜黑芥子酶活性剩下4.08%,几乎完全失活。本试验中的热介质为蒸汽,与热水相比,具有更高的温度、更高的热量和更大的比容,且热穿透能力更强,因而完全钝化黑芥子酶活性的时间较热水处理大大缩短。同时处理温度越高,芥子油苷越容易受热分解。提高蒸汽压力意味着增大了蒸汽处理的温度,这说明高温一方面使黑芥子酶失活,另一方面使芥子油苷分解为不同的产物。3.2不同高纯水和高温汽漂后对花椰菜硫苷的影响热水烫漂以水作为传热介质,营养成分会因分散和过滤进入烫漂液中,而生产上烫漂液往往被废弃掉,造成原料营养成分的大量损失,HTSTSB以蒸汽为传热介质,因而没有这部分额外损失。Volden等研究了3种工艺过程:热烫、煮沸和蒸气加工对花椰菜硫苷含量和其它抗氧化参数的影响,得出蒸气加工对硫苷的影响最小。本试验的结果也表明,HTSTSB热处理过程后玛咖中重要的功效物质芥子油苷与热水烫漂相比保留更多,同时HTS