红曲代谢产物Monascin的制备及其抗肿瘤作用研究

红曲代谢产物Monascin的制备及其抗肿瘤作用研究2课题背景及立论依据红曲霉菌—我省最具特色的微生物资源，经固、液态发酵产红曲红曲—可用于酿酒、制醋，可作为食品染色剂和调味剂，含有多种活性代谢产物，作为中药红曲产品主要有发酵用红曲、功能性红曲和色素添加剂，其中色素红曲、红曲红和红曲黄色素等占红曲产业链总产值的80%以上红曲霉菌主要代谢产物—红曲色素、Monacolin类化合物、γ-氨基丁酸、桔霉素等3课题背景及立论依据

——红曲色素红曲霉菌次级代谢产物混合色素,醇溶性红曲色素6种，水溶性4种醇溶性色素主要分为红、橙、黄色素3类，每类色素各含两种色素单体4课题背景及立论依据

——红曲色素生理活性抗菌、降胆固醇、抗阿尔兹海默症、抗癌Ankaflavin（Y2）对人肝癌细胞HepG2具有细胞毒性，IC50值约为15μg/ml，而在同样浓度下，对正常细胞系MRC-5和WI-38却几乎没有细胞毒性。形态学变化研究和流式细胞术检测周期分布，发现有染色体皱缩及碎片，并有明显的G1亚峰口服Monascin（Y1）可以抑制过氧化亚硝酸盐或紫外线诱导的皮肤癌Rubropunctatin（O1）对人神经瘤细胞SH-SY5Y、人胃癌细胞BGC-823、AGS和MNK45均具有显著的增殖抑制作用，而对人正常胃粘膜上皮细胞GES-1则无细胞毒作用高纯度红曲色素具有成为新型抗癌药物的潜力5课题背景及立论依据

——细胞凋亡与细胞分化细胞凋亡——程序性细胞死亡，主要有线粒体路径和死亡受体路径诱导分化——恶性肿瘤细胞在体外分化诱导剂的作用下，向正常细胞方向分化逆转的现象。典型事例：全反式维甲酸（ATRA）治疗急性早幼粒细胞白血病研究热点——从天然资源（包括动植物、微生物等）中分离得到高纯度的组分，并评价其抗癌活性和探索作用机理6实验路线高纯度红曲色素单体的制备红、橙、黄3组红曲色素抗肿瘤作用初筛(MTT实验)红曲色素单体对肿瘤细胞生长抑制作用机制探索对人胃癌细胞AGS生长抑制作用机理探索对人恶性黑色素瘤细胞A375生长抑制作用机理探索71

高纯度红曲色素提取分离乙醇萃取-高速逆流色谱法分离-结晶组合技术水提30%醇提70%醇提70%醇提——红（Red-1和Red-2）、橙（Orange-1和Orange-2）、黄（Yellow-1和Yellow-2）色素为主要成分的提取液1.1

提取图1-1HPLC-PAD检测醇溶性红曲色素组分81高纯度红曲色素提取分离筛选出正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水溶剂系统，制定了两步分离策略，实现了6种组分的分离纯化，纯度高于90.0%1.2

高速逆流色谱法n-hexane–ethylacetate–methanol–water(10:0:7.5:2.5,v/v/v/v)n-hexane–ethylacetate–methanol–water(2.5:7.5:5:5,v/v/v/v)图1-2高速逆流萃取法分离醇溶性红曲色素91

高纯度红曲色素提取分离采用热饱和溶液法，获得块状（红）、针状（橙）、片状（黄）晶体，纯度大于98.5%1.3

结晶法图1-36种红曲色素样品的检测102红曲色素对不同肿瘤细胞生长的影响A375A431PC-3AGS2.1MTT初筛（红、橙、黄3组色素，24、48h）112红曲色素对不同肿瘤细胞生长的影响红曲色素对4种细胞系的IC50（μmol/L）groupsTime（h）Celllines恶性黑色素瘤A375表皮鳞癌细胞A431前列腺癌细胞PC-3胃癌细胞AGS红（R1+R2）24181.6251.5147.3121.348128.26170.8131.144.8橙（O1+O2）241051.5806.9985.4723.3482705.7332.2704.0198.3黄（Y1+Y2）24138.46146.6108.927.34868.1148.674.819.5Taxol2417.1——15.6488.9——4.02.1MTT初筛122红曲色素对不同肿瘤细胞生长的影响结论：Monascin对正常组织细胞的抑制作用不及紫杉醇，其毒副作用较小，具有一定的安全性。图2-1Monascin和紫杉醇对胃粘膜上皮细胞GES-1细胞生长的影响（24h）2.2MTT实验检测细胞毒副作用133Monascin对AGS生长抑制作用机制研究control10μmol/L80μmol/L40μmol/L3.1

细胞核形态观察均匀浓集皱缩碎裂图2-2Hoechst33258染色观察细胞核形态（24h）143Monascin对AGS生长抑制作用机制研究剂量(μmol/L)G0/G1SG2/MSub-G0/G1044.3534.5721.081.991041.0233.2825.701.622039.7530.2230.037.434043.7225.1431.1517.808043.6626.2830.0530.01处理时间G0/G1SG2/MSub-G0/G11252.2029.1318.674.892439.7530.2230.037.433627.4144.8327.7626.274837.7646.9615.2937.003.2流式细胞仪检测细胞周期分布153Monascin对AGS生长抑制作用机制研究controlMonascin(20μmol/L)Monascin(40μmol/L)Monascin(10μmol/L)Taxol(10μmol/L)Taxol(20μmol/L)3.3AnnexinV/PI检测细胞凋亡M1M2M3M4163Monascin对AGS生长抑制作用机制研究1、control2、20μmol/L3、40μmol/L4、80μmol/LMonascin可能通过抑制Survivin表达，诱导AGS发生凋亡3.4Survivin与Bcl-2含量检测173Monascin对AGS生长抑制作用机制研究随着Monascin浓度的升高，Caspase-3酶活力显著提高；50μmol/L作用24h后，其酶活力是control组的2.88倍。随着时间的延长，酶活力也显著增长。3.5Caspase-3活性检测184Monascin对A375生长抑制作用机制研究control20μmol/L40μmol/L60μmol/L80μmol/L100μmol/L4.1

细胞核形态观察细胞核基本呈淡蓝色均匀分布状194Monascin对A375生长抑制作用机制研究S期和G2/M期细胞的比例显著下降，G0/G1期细胞比例显著升高。48h后，90.4%的细胞被阻滞在G0/G1期，而未见明显的亚二倍体峰Control6h12h

18h24h48h53.9%90.4%4.2

流式细胞仪检测细胞周期分布204Monascin对A375生长抑制作用机制研究Monascin处理的A375细胞中黑色素含量显著增大Gro