DB21-T+3794-2023水质+底栖动物鉴定+DNA条形码法

ICS13.060.99CCSZ10

DB21辽 宁 省 地 方 标 准DB21/T3794—2023水质底栖动物鉴定DNA条形码法WaterQuality—IdentificationofMacrobenthos—DNABarcoding2023-08-302023-08-302023-09-30辽宁省市场监督管理局发布DB21/T3794—2023目次前言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1缩略语 2方法原理 3试剂和材料 3仪器和设备 4样品 4分析步骤 4结果计算 7质量保证与质量控制 7废物处理 813注意事项13注意事项 8附录A（资料性）序列搜索与比对 9附录B（资料性）进化树的构建与遗传距离的计算 11参考文献 13IDB21/T3794—2023DB21/T3794—2023DB21/T3794—2023DB21/T3794—2023前言GB/T1.1-20201请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省生态环境厅提出并归口。本文件起草单位：辽宁省生态环境监测中心。本文件主要起草人：丁振军、李杨、姜永伟、王星蒙、问青春、王秋丽、张爽、胥学鹏、张峥、卢雁。本文件为首次发布。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省生态环境厅（辽宁省沈阳市浑南区双园路0甲，联系电话话II（03话II水质底栖动物鉴定DNA条形码法警告：EBDNA规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T30989高通量基因测序技术规程HJ710.8生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物T/CSES81淡水生物监测环境DNA宏条形码法下列术语和定义适用于本文件。3.1底栖动物macrobenthos0.5mm（40）孔径网筛的无脊椎动物。下列术语和定义适用于本文件。3.1底栖动物macrobenthos0.5mm（40）孔径网筛的无脊椎动物。[来源：HJ710.8-2014，3.2，有修改]3.2细胞色素c氧化酶亚基IcytochromecoxidasesubunitI，COIcIDNA3.3引物primerDNA/或终止位点的，具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。[来源：GB/T30989-2014，3.11]3.4退火annealing模板双链DNA经热变性、双螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到特定温度，使引物与该模板DNA1单链重新配对，形成新的双链分子的过程称为退火。3.5聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCRDNADNADNADNAdNTPDNADNA[来源：GB/T30989-2014，3.14]3.6降落PCRtouchdownPCR，TDPCR一种退火温度逐渐降低的多循环PCR反应程序。由于前期退火温度高，引物结合难度增大，错配几3.7序列比对sequencealignment3.8遗传距离geneticdistance遗传距离指不同的种群或种之间的基因差异的程度，并以数值进行度量。3.9生物大分子序列比对搜索工具BasicLocalAlignmentSearchTool，BLAST一种基于局部比对算法的搜索工具，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系。3.10分子进化遗传分析工具MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，MEGA一种用于分析物种亲缘关系、分子功能、遗传进化等的工具。可以实现序列比对和调参建树等功能。缩略语下列缩略语适用于本文件。EB——溴化乙锭（Ethidiumbromide）DNA——脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）COI——细胞色素氧化酶亚基I（cytochromecoxidasesubunitI）PCR——聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）BLAST——生物大分子序列比对搜索工具（BasicLocalAlignmentSearchTool）MEGA——分子进化遗传分析工具（MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis）2方法原理KDNADNADNA。PCR5次循环，目标OI序列可被扩增约5倍。与NA结合的B会被紫外光激发发出强烈的橙红色荧EBCOICOINCBIBOLDNJ0.02cMDNA条形码法鉴定底栖动物流程图见图1。提取总电泳、凝胶成像检查提取总电泳、凝胶成像检查PCRDNA总DNA提取情况COIPCR绘制进化树并计算序列搜索结果判读委托测序遗传距离 与比对图1DNA条形码鉴定底栖动物流程图试剂和材料121℃灭菌。C6。70%乙醇。aDTA，CH4NOaHO。ris，CH1O。（DS，2H5Oa。10%SDSSDS10g60mLpH7.2100mL，常温备用。HCl。Tris（pH7.7～8.1，市售。K400U/mL（市售。EB10mg/mL（市售。EB吸取10μLEB储存液加入200mL去离子水中，混匀，终浓度为0.5μg/mL。琼脂糖（标准熔点。31%琼脂糖凝胶：0.3g30mL1×TEpH7.5～8.5（市售。50×TAE（市售。1×TAE取20mL50×TAE缓冲液，去离子水定容至1L，常温备用。pH缓冲范围7.8～8.8。6×蔗糖凝胶上样缓冲液：含溴酚蓝、EDTA（市售。×aqCRixaqNANTP、glCR（市售。NA（：100bp～2000bp，包含6条单一DNA条带，分别为：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。PCR引物：CO490（GCAAAAACATAAGTATGG，C2198AACTTAGGTGACAAAAACA。7仪器和设备0.001g。干式恒温器：56℃可调。PCRPCR100V离心机：12000r/min凝胶成像仪：具有紫外成像功能。移液器：2.5μL、10μL、100μL、200μL、1mL。样品样品采集底栖动物的采集按照HJ710.8相关规定执行。样品保存43DNA发生分解。分析步骤DNA组织样本宜取自底栖动物肌肉部位，该部位线粒体丰富，易于获得较好的扩增效果。可选取底栖动4物个体腿部或胸部组织，如底栖动物个体较小（如摇蚊幼虫，可将整个个体放入EP管中进行总NA提取。25mg1.5mLEP500μLE（.1500μL0%DS溶液（.70L蛋白酶K（.0，6℃恒温2～4hEPTris（6.9）600μL10min，12000r/min10min。取上清液加入/2（.8、/2体积的ris0in，200/mn0in。10min，12000r/min10min24201h～2h，12000r/min10min，小心倒掉上清液。使用470400μL1min，12000r/min2min，弃去上清液。70%400μL12000r/min2min，弃去上清液。EP100μLDNA20DNA2。500μLTE25mg56℃恒12000缓冲液，100μL 加入Tris饱无水乙醇清洗 温至完r/min10%SDS溶液，20 和酚600μL数次 全消化心10minμLK取上清液加入取上清液加1/224℃1200012000入相同体积体积的三氯甲烷、的无水乙醇，r/minr/min离心的三氯甲 1/2体积的Tris饱-20℃沉淀10min10min烷，混匀 和酚，混匀1～2h弃上清，用弃上清，100μL12000 120004℃的70%乙 打开EP管 离子水溶解DNAr/min离心 r/min离心醇400μL清 盖挥发残 沉淀，-20℃保10min 2min洗杂质 留乙醇 存重复一次重复一次2DNA9.2总DNA的电泳检测提取的总DNA应进行琼脂糖凝胶电泳检测，以判断总DNA提取情况。1TAE52.5μLDNA（6.20）小心加入到第DNA6×蔗糖凝胶上样缓冲液（6.18）5:12.5μL计算电泳槽正负极间的距离，调节电泳仪，使电压不超过5V/cm～8V/cm。开始电泳，当溴酚蓝染料条带移动至凝胶约2/3位置时，电泳结束。EBEBEB30min。取出后清水漂洗两次。注：也可使用其他染料替代EB，具体使用方法参见相关试剂说明书。DNADNADNA2000bp。PCRPCR5060452130455PCR35PCR12。1PCR序号试剂加入量（μL）12×TaqPCRMix预混液252模板DNA2.53正向引物24反向引物25无菌水18.5662PCR步骤温度（℃）时间（min）循环次数预变性945变性940.5退火温度每两次循环降低1℃，30次循环退火60～450.5延伸721.5变性940.55次循环退火450.5延伸721.5延伸7210保存4——扩增产物的电泳检测扩增产物按步骤9.2进行电泳检测。EB扩增产物电泳结束后按步骤9.3进行EB染色。PCR9.9测序扩增的COI序列可委托专业测序公司进行基因测序，测序结果文件为fasta格式。结果计算9.9测序扩增的COI序列可委托专业测序公司进行基因测序，测序结果文件为fasta格式。结果计算序列搜索与比对NCBIBLAST95%，EGA附录A。NJKimura2-parameter（K2P）模型，自展值（Bootstrap）1000，绘制J附录。结果判读0.02cM，即可判定测试样品与该序列为同一物种。质量保证与质量控制实验前的分类鉴定每次实验前应先对物种进行目或科的简单分类鉴定。平行样的测定每次实验需开展平行双样测试，两次鉴定结果需完全相同，否则应查找原因并重新测试。7废物处理对于废弃的EB溶液可做如下处理：对于EB含量大于0.5mg/mL的溶液，将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/mL。加入一倍体积的.5o/LMO.5olL.5olLNaOH，混匀后按有毒有害废物处理。EB0.5mg/mL1mg/mL1注意事项EBEBEB88附录A序列搜索

（资料性）输入需要搜索的序列序列搜索在NCBI网站（https:///）上进行，选择“Resources—DNA&RNA输入需要搜索的序列A.1NucleotideBLASTA.2BLAST9LAT（aicLcallinmeteachooluceotdeLAT”按钮图A.1LATA.1NucleotideBLASTA.2BLAST9A.3BLAST序列比对fastaMEGAfastabyClustalW”进行序列比对，比对结果（A.4）另存为“.meg”格式进行进化树的构建和遗传距离的计算。图A.4序列比对结果界面图A.4序列比对结果界面10附录B进化树的构建

（资料性）进化树的构建与遗传距离的计算egEGAostrct/esteghbr-Jinigreeoostrpetod000imra-pramterodl图1，点击“OK”开始构建进化树。构建的进化树如种类过多矩形树无法全部显示，可选用圆形树展示（图B2图B.1使用K2P模型构建NJ进化树的设置界面11图B.2使用K2P模型构建的NJ进化树遗传距离的计算点击“oputearwieisancsoostrpetod000次，imra-araeteroel图3K图B.3基于K2P模型计算的遗传距离12参考文献HJ710.8-2014,生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物[S].ArnotDE,RoperC,BayoumiRAL.DigitalcodesfromhypervariabletandemLyrepeatedDNAsequencesinthePlasmodiumfalciparumcircumsporozoitegenecangeneticallybarcodesisolates[J].Molecularandbiochemicalparasitology,1993,61(1):15-24.TautzD,ArctanderP,MinelliA,etal.DNApointsthewayaheadintaxonomy[J].Nature,2002,418(6897):479-479.HebertPDN,CywinskaA,BallSL.BiologicalidentificationsthroughDNAbarcodes[J].ProceedingsoftheRoyalSocietyofLondonB:BiologicalSciences,2003,270(1512):313-321.HebertPDN,Rat