濒危药用植物棉花秦休眠芽的玻璃化超低温技术研究

濒危药用植物棉花秦休眠芽的玻璃化超低温技术研究

近年来，新开发的玻璃超低温储存方法是将细胞或组织置于冷冻保护溶液中，脱除额量水，并在冷冻过程中形成对细胞没有破坏作用的晶界，形成玻璃状态的储存方法。玻璃化法因方法简单、快速,保存效果较好而被广泛研究。药用植物中很多是多年生草本植物,在冬季会形成地下休眠芽,本试验首次以麻花秦艽地下休眠芽为保存材料,采用玻璃化法对麻花秦艽进行超低温保存,获得了很高的成活率。该研究结果为进一步提高玻璃化超低温保存成活率,长期稳定地保存濒危药用植物种质资源开辟了一条新途径。1材料和机器1.1菌株采集和保存麻花秦艽(GentianastramineaMaxim.)种苗,2011年3月采挖于甘肃岷县,覆土后于2℃冰箱中保存备用。由甘肃中医学院林丽高级实验师鉴定。1.2试剂乙二醇、二甲基亚砜、丙三醇、蔗糖,以上化学试剂为进口或国产分析纯以上。1.3菌锅、智能人工气候箱、液氮罐超净工作台(苏州净化SW-CT-IFD);高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂LDZX-30FB);智能人工气候箱(QHX-250-BS-III);液氮罐(亚西YDS-3);恒温水浴锅(西安HH-1)。2方法2.1材料的消毒将麻花秦艽休眠芽先用75%乙醇漂洗20s,然后在0.1%升汞中灭菌8min,最后用无菌水冲洗3～4次,备用。2.2培养基的制备将休眠芽灭菌后剥至2.0～2.5mm大小,接种于含有不同蔗糖浓度的MS培养基中分别暗培养1d,然后将休眠芽转至1.8mL的冻存管中,加入1mL装载液(2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖),20℃处理不同时间,吸去装载液。2.3pvs3冻存液的制备玻璃化液选用PVS1(22%甘油+13%乙二醇+13%聚乙二醇+15%二甲基亚砜)、PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖)和PVS3(50%甘油+50%蔗糖),于0℃下处理60min,移去原液,换新鲜的PVS2溶液,然后将冻存管迅速投入液氮中。在选出最佳玻璃化液的基础上,考察玻璃化液处理不同时间对保存成活率的影响。2.4休睡眠芽的检测休眠芽于液氮中保存24h后,取出冻存管,40℃水浴中化冻2～3min,弃去保护液,用卸载液(含1.2mol/L蔗糖的无机盐MS培养基)冲洗2次,每次10min。取出休眠芽,用无菌滤纸吸去残留在表面的培养基,一部分投入0.5%氯化三苯基四氮唑溶液中,在35℃的温箱中保温处理2h左右,检测休眠芽生活力;另一部分接种在含3%蔗糖的MS培养基中暗培养1d,然后再转移到2种含不同激素浓度的MS培养基中,暗培养一周后转移到光下培养。2周后统计成活率(以休眠芽变绿为标准)。2.5培训条件培养温度为22℃,光照强度2000lx,光照时间12h/d。3结果与分析3.1蔗糖不同浓度对休闲芽成活率的影响本研究以蔗糖作为渗透性保护物质,采用含不同蔗糖浓度的MS培养基进行暗培养(见表1),结果表明,经蔗糖预培养的休眠芽超低温保存后的成活率显著高于不进行蔗糖预培养的休眠芽(P<0.05)。在含0.3mol/L、0.5mol/L和0.7mol/L蔗糖的MS培养基中依次培养1d的休眠芽成活率最高,达82.6%,无预培养的休眠芽成活率最低,为33.3%。其原因可能是被冷冻材料未能得到足够的耐脱水能力和低温保护能力,在投入液氮时植物组织内部结构严重破坏,导致成活率降低。因此,适宜浓度和时间的蔗糖预培养对休眠芽超低温保存是十分必要的。本实验确定在含0.3mol/L、0.5mol/L和0.7mol/L蔗糖的MS培养基中依次培养1d为最佳预培养条件。3.2不同处理不同的成活率为初步降低组织的含水量,避免由于渗透压变化太大对材料造成伤害,本试验采用装载液对休眠芽进行处理,于20℃分别处理10min、20min、30min、40min。其中处理20min成活率最高,达83.3%,处理10min成活率仅为41.7%,超过20min随着处理时间的延长成活率也随之下降(见图1)。因此,适宜的装载时间可以很大程度的提高成活率,其中以2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖溶液装载20min为最适宜的装载时间。3.3pvs2、pvs3处理对休醉芽成活率的影响本试验采用了3种玻璃化保护液、0℃处理休眠芽60min,结果显示休眠芽均有成活,其中PVS2处理成活率达到66.7%,与PVS1、PVS3处理后的成活率差异显著(P<0.05)。见表2。因此,在秦艽休眠芽超低温保存时PVS2为最佳的玻璃化保护液。3.4不同处理不同保护液对成活率的影响本试验采2.0～2.5mm的休眠芽在0.3mol/L、0.5mol/L和0.7mol/L蔗糖MS培养基预培养1d后,用装载液处理20min,再经PVS2,0℃条件下分别处理20、40、60、80min。恢复培养的结果表明(见图2),40min成活率最高,达83.3%,处理20min成活率为75.0%。与PVS2处理40min相比,处理80min时成活率显著下降(P<0.05),其原因是随着脱水时间的延长,细胞脱水造成的结构损伤以及受到玻璃化溶液的离子毒害逐渐加重。因此,在保证有足够高的成活率的前提下,应尽量缩短玻璃化保护液处理时间。秦艽休眠芽超低温保存中PVS2处理时间以40min为宜。3.5休醉芽的成活率测定秦艽休眠芽在含有0.3mol/L、0.5mol/L和0.7mol/L蔗糖MS培养基中预培养1d后,分别剥取1.0～1.5mm、2.0～2.5mm、5～6mm、10～11mm长的休眠芽进行玻璃化超低温保存。结果表明,5～6mm和10～11mm的大休眠芽明显具有较高的成活率,达77.8%,与1.0～1.5mm和2.0～2.5mm的小休眠芽成活率差异显著(P<0.05)(见表3)。有研究表明,材料大小对脱水的难易影响很大。材料体积大,不利于脱水,但容易再生;体积小,易于脱水,但不易再生,而且冷冻保护剂对材料的毒害较大,从而影响成活率。但本试验结果表明,较大的休眠芽成活率显著高于小休眠芽,其原因可能是休眠芽本身已脱去一定量的水分,具有较强的抗冷冻能力,加之大芽容易培养成活并再生植株。因此,以休眠芽为保存材料时宜选用大一些的芽。3.6细胞生长和成活率将化冻的材料除去保护液,用卸载液冲洗,吸干残留于休眠芽表面的溶液,接种于含3%蔗糖的MS培养基暗培养1d,一部分用TTC染色法初步检测其生活力(见图3),结果表明所有的休眠芽均染成红色,生活力高达100%,但实际成活率为83.3%。由此看出,TTC法测定的相对成活率与实际成活率之间具有一定的相关性,但相对误差较大,不能很准确地表征细胞存活状态。一部分转接于含2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA和0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA的MS培养基中暗培养一周后转至光下培养。两种恢复生长培养基中的成活率均很高。在添加低浓度6-BA培养基中的休眠芽经培养2周后休眠芽变绿(见图3B),开始生长,6周后基部稍有膨大,产生少量黑色愈伤组织,同时诱导产生2～3个新芽(见图3C),培养9周后试管苗生长迅速而健壮(见图3D)。但添加高浓度6-BA培养基中的休眠芽在光下培养6周后发现,休眠芽未能再生植株而是脱分化形成大块深绿致密的愈伤组织,并分化出少量不定根(见图3E)。因此,在休眠芽培养再生植株时,要注意选用适宜的激素浓度配比,尽量避免产生愈伤组织,以确保再生植株的遗传稳定性。4超低温保存技术4.1在细胞、组织和其它器官的玻璃化超低温保存中,普遍都要采用预培养,才可获得一定的成活率。但在本试验中,无预培养的休眠芽超低温保存后成活率就可达到33.3%。其原因可能是自然条件下休眠芽中贮藏物质增多,水分减少,原生质胶体性质发生变化,代谢活动钝化,抗逆性增强,在超低温冷冻时可避免脱水、冷冻的严重伤害,从而获得较高的成活率。4.2在很多植物的超低温保存中均采用1～3mm的茎尖作试材,但剥取茎尖是一项很费时的工作,而且茎尖再生率较低。本研究采用10mm大小的休眠芽超低温保存的成活率高达83.3%,同时,在休眠芽离体培养时,只要筛选出适宜的再生培养基,就可通过丛生芽发生途径再生植株,遗传稳定性很强。这不仅简化了保存程序,也降低了再生的难度。4.3本试验建立的秦艽地下休眠芽玻璃化超低温保存技术体系与艾鹏飞研究建立的柿属植物地上休眠芽的技术体系,除芽的大小和再生培养基及培养条件外,其它技术参数均相同。由此可见,休眠芽是超低温保存的理想材料,很有希望在不同科属或同一属间建立较为通用的玻璃化超低温保存技术A.被TTC染红的芽B.超低温保存2周后成活的芽(再生培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA)C.恢复培养后6周后的芽D.恢复培养后9周后的再生植株E.恢复培养后9周后再生培养基(MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)中产生的愈伤组织体系,有应用于实践的巨大潜力。因此,值得进行广泛而深入的研究。4.4玻璃化溶液可使组织脱去水分并缓和地渗入组织,在冻存中进入玻璃化状态可有效地保护细胞结构。