第二章基因工程的酶学基础

第二章基因工程的酶学基础第1页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第2页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶第3页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院本章重点掌握的内容限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。II型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响酶活性的因素。DNA聚合酶的种类及性质其它常用工具酶的功能及其用途。第4页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶

任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制

限制/修饰系统

(R-M,Restriction-modificationsystem)第5页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)EOP=10-4（限制作用）EOP=10-4（限制作用）EOP=1（修饰作用）修饰的phageλ(K)

人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。一、寄主的限制与修饰现象EOP

Efficiency

of

plate成斑率第6页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶第7页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象

限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。

限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。

第8页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。

修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。第9页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象

1968Linn和Arber从E.coliB中发现限制酶Ⅰ

1970Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ

1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖第10页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象

寄主控制的限制与修饰的作用

一是保护自身的DNA不受限制；

二是破坏外源DNA使之迅速降解。

基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。

第11页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶二、限制性内切酶的类型

限制性核酸内切酶（限制性酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。

主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点双功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源二聚体Mg2+

4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+

距识别序列下游24-26bp处随机性切割基因工程中使用注：SAM为S－腺苷甲硫氨酸第12页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶1.I型限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。如EcoB和EcoK。（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC

第13页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶（2）切割位点

在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。

（3）作用机理

需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。

Recognizesite

cut

1-1.5kb

第14页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶2.II类限制性内切酶首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是HindⅡ

（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA的来源无关。ABCC’B’A’

A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’

或第15页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶（2）切割位点

识别位点处。

切开双链DNA。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：

EcoRI5’-G

AATTC-3’3’-CTTAA

G-5’PstI5’-CTGCA

G-3’3’-G

ACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GAT

ATC-3’3’-CTA

TAG-5’

产生平齐末端第16页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用第17页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶3.III类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游24-26bp)，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。EcoP1:AGACC

EcoP15:CAGCAG

在基因工程操作中用途不大。第18页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能（具甲基化）异源三聚体ATPMg2+SAM距识别序列1kb处随机性切割单一功能同源二聚体Mg2+

4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能（具甲基化）异源二聚体ATPMg2+

距识别序列下游24-26bp处随机性切割核酸限制性内切酶的类型及主要特性第19页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶三、限制性内切酶的命名

1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：

1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。

大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；

流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。

2.

用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如EcoK,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。

3.

如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV。

4.

限制酶前面要带上R（Restriction)，

修饰酶前面要带上M（Modification）(现已省略)。第20页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶三、限制性内切酶的命名

EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号

若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。

第21页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶四、

Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性（一）识别序列识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性

4bp

HpaⅠ

C

CGG

HaeⅢ

GG

CC

5bp

AvaⅡ

G

GWCC

EcoRⅡ

CCWGG

6bp

BamHⅠ

G

GATTC

SmaⅠ

CCC

GGG

11bp

Bg1Ⅰ

GCCNNNN

NGGC

12bp

BstXⅠ CCANNNNN

NTGC

N=A,T,G,C第22页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶四、Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性（二）切割方式

Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3‘位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。

第23页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶1.5’突出的末端第24页，课件共97页，创作于2023年2月EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C…5’EcoRI37℃5‘…G--C--T--G--OHP--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A—POH--G--C--T--C…5’

退火4--7℃5‘…G--C--T--G--A--A--T--T--C--G--A--G…3’3‘…C--G--A--C--T--T--A--A--G--C--T--C…5’生命科学学院第一节限制性核酸内切酶第25页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶2.3’突出的末端第26页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶PstI等产生的3‘粘性末端5‘…C--T--G--C--A--G…3’3‘…G--A--C--G--T--C…5’PstI37℃5‘…C--T--G--C--A--OHP--G…3’3‘…G--POH--A--C--G--T--C…5’

退火4--7℃5‘…C--T--G--C--A--G…3’3‘…G--A--C--G--T--C…5’第27页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶粘性末端的意义

①连接便利

i）不同的DNA双链：

只要粘性末端碱基互补就可以连接。

这比连接两个平齐末端容易的多。

第28页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶第29页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶ii）同一个DNA分子内连接：

通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。

②

5’末端标记

凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。

凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。

③

补平成平齐末端

粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。第30页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶3.平头末端第31页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶PvuII等产生的平头末端5‘…G--C--T--C--A--G--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--G--A--C--C--T--C…5’PvuII37℃5‘…G--C--T--C--A--G--OHP--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--POH--G--A--C--C--T--C…5’第32页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节限制性核酸内切酶第33页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶四、

Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性（二）切割方式

同裂酶（isoschizomers）：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生不同或相同的末端。

同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大(相容性末端)。第34页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶同尾酶举例：如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN

常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、

BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。第35页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件

1U

核酸内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，保温1小时，使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。

大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：

Tris-HCl50mmol/LpH7.5

MgCl210mmol/L

NaCl0-150mmol/L

DTT1mmol/L

Volume20-100μL

Temperature37℃

Time1-1.5h（DDT：二硫苏糖醇

BSA：牛血清蛋白)0-50mM低盐酶100

mM中盐酶150

mM高盐酶Buffer第36页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件

在灭菌的1.5ml离心管中进行限制性酶切反应:

20μl体积反应体系如下：

DNA0.2-1μg

10×酶切buffer2.0μl

限制性内切酶

1-2U（单位）

加ddH2O至

20μl

多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。第37页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件

酶切反应的终止

EDTA（终浓度10mmol/L)或SDS[终浓度0.1%(W/V)]65oC温育

20min

酚/氯仿抽提，乙醇沉淀

酶解结果鉴定

琼脂糖电泳第38页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件

完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。

局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。

通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。第39页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件

酶切的注意事项:

1.购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。

进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，

再从

-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。

2.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。

3.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。

4.注意星号酶切活力。第40页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（一）酶的纯度

（二）DNA样品的纯度

DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，都有可能抑制酶活性。

可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间第41页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（三）DNA样品的甲基化程度

采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。

第42页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（四）酶切反应的温度与时间

多数标准反应温度是37℃，如SmaI为25℃或30℃，SfiI为50℃

。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。酶解时间可通过加大酶量而缩短，反之酶量较少时，可通过延长酶解时间以达到完全酶解DNA的目的。第43页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（五）DNA的分子构型

某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达20倍。酶最适温度oC

酶最适温度oC

酶最适温度oC

ApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525第44页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（六）限制性核酸内切酶的反应缓冲液

高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”（staractivity）现象。

EcoRI*代表EcoRI的星号活力。

星活性的特点:限制酶识别序列特异性降低

例如：EcoRI（高pH值或低盐离子强度）

5’GAATTC3’变成5’NAATTN3’，另有一种情况是对AATT中的A、T分辨不严格商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。第45页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶发生星反应的限制酶和条件

1)反应体系中甘油含量过高（>5%，V/V），应使用能完全酶切DNA的最小酶量避免这种情况的发生；

2)限制酶用量过大（>100U/ugDNA）；

3)低离子浓度（<50mmol/ml）；

4)高pH（PH8.0）

5)含有有机溶剂（如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等）；

Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子存在。

6)不同的限制酶出现的星号活力的阈值也不一样，常易发生星号活力的酶有：EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、ScaI、SalI、HinfI等。第46页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶

抑制星号活性的方法

1)尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。

2)尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。

3)将离子浓度提高到100-150mM（若酶活性不受离子

强度影响）。

4)将反应缓冲液的pH值降到7.0。

5)二价离子用Mg2+。第47页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的应用：重组DNA前的切割

构建新质粒构建物理图谱DNA分子杂交

用限制性内切酶消化受体DNA制备DNA探针

亚克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究第48页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第一节

限制性核酸内切酶本节重点掌握的内容

1、限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。

2、II型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响酶活性的因素。第49页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶剪刀—限制性内切酶针线、胶水—连接酶第50页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶DNA连接酶第51页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶一、概念与机理

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。第52页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶一、概念与机理

DNA连接酶只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。

注意：缺口（或称切口）和裂口的区别！！！！！注：关于“Gap”与“Nick”的概念。

1.Gap裂口：即DNA裂口，是指双链DNA分子上的某一条链失去一个或数个核苷酸时所出现的DNA单链断裂。

GapinDNAistheabsenceofoneormorenucleotidesinonestrandofduplex.

2.Nick缺口：即双链DNA分子的单链断裂，即在相邻的2个核苷酸分子之间，失去了(移走了)一个磷酸二酯链。NickinduplexDNAistheabsenceofaphosphodiesterbondbetweentwoadjacentnucleotidesononestrand.第53页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶DNA连接酶对不同DNA分子的连接作用第54页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶二、DNA连接酶的种类（一）T4噬菌体DNA连接酶

特点：

只连接ds-DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基

用途：

1)粘性末端的连接

2)平头末端的相连

抑制剂:PO43->5mM,NaCl>25mM,Ca2+>0.1mM第55页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶二、DNA连接酶的种类(二）大肠杆菌DNA连接酶连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子(三）热稳定DNA连接酶以NAD为辅助因子，优先作用于缺口连接酶使用注意事项

1)DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接；

2)只能连接双链DNA分子的单链切口(nick)；

3)不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的缺口（gap）。DNA连接酶的部分性质连接酶底物辅助因子巯基试剂粘性末端平末端DNA-RNA杂合体RNA-RNA杂合体大肠杆菌DNA连接酶可行可行不行不行NAD+Mg2+不需要T4DNA连接酶可行可行可行可行ATPMg2+

需DTT噬热菌DNA连接酶可行不行不行不行NAD+Mg2+

需要第56页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶DNA连接酶应用图解（一）分子间的连接

（二）分子内的连接第57页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶三、DNA连接酶的反应体系

四、影响连接反应的因素

1.插入片段与载体的浓度比例：2-10:1增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象

2.反应温度：一般4~16℃

3.ATP浓度

10×T4DNALigaseBuffer 1μlpMD18-T（30ng/μl）1μl已纯化的PCR产物 Xμl*T4DNALigase2~3WeissUnitsddH2O 至10μl第58页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶平末端DNA片段的连接(补充)1.同聚物加尾法

第59页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶平末端DNA片段的连接(补充)2.衔接物连接法

第60页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第二节

DNA连接酶平末端DNA片段的连接(补充)3.DNA接头（adaptor）连接法

问：衔接物和DNA接头有什么区别？？？衔接物（linker）是一种人工合成的双链DNA短片段，其上具有一个或数个在将与其连接的载体DNA上不存在的限制酶识别位点，可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物，再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割，用常规方法连接的方法，提高平齐末端间的连接作用效率。也可利用接头进行DNA平齐末端门的连接。接头（adaptor）是一种具有粘性末端的短核昔酸双链，它与平齐末端连接后，不用经过切割即可与载体相连。第61页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶DNA聚合酶

3’

5’外切酶活性5’

3’外切酶活性聚合速率

持续能力

大肠杆菌DNA聚合酶

低

有

中

低

Klenowfragment

低

无

中

低

T4DNA聚合酶

高

无

中

低

T7DNA聚合酶

高

无

快

高

化学修饰T7DNA聚合酶

低

无

快

高

遗传修饰T7DNA聚合酶

无

无

快

高

逆转录酶

无

无

低

中

TaqDNA聚合酶

无

有

快

高

DNA聚合酶（DNApolymerase)是指能在引物和模板的存在下，将脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。分为：依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶。第62页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I

1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。第63页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶CCGGGCTATCGGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG1.5’→3’聚合酶活性GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coliDNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′2.5’→3’外切酶活性3.3’→5’外切酶活性

DNA聚合酶的三种活性第64页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I用途：

1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）

2）补齐5’-突起端

3）合成第二条cDNA

4）切口移位制备探针其中用途2)和3)常用大片段第65页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段

（一）基本性质大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即Klenow片段。

Klenow片段仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。

第66页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段

（二）用途

1.3’端补平：补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。

2.DNA3’末端标记:在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。5’klenow

klenow

5’

第67页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段

（二）用途

3.cDNA第二链的合成

mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow

5’3’3’

5’

5’3’

引物

第68页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶三、T4噬菌体DNA聚合酶（一）T4DNA酶的基本特性有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性（降解单链更快）

。

在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

第69页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶三、T4噬菌体DNA聚合酶（二）用途第70页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶

（一）T7噬菌体DNA聚合酶从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成，已知DNA聚合酶中持续结合能力最强的一个。

（二）T7噬菌体DNA测序酶通过对T7DNA聚合酶进行化学修饰，去除3’

5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。

第71页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶五、TaqDNA聚合酶

来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。

结构：单亚基MW=94000d。

特点：热稳定性，70℃反应2h残留活性为原来的90%；93℃反应2h残留活性为原来的60%；94℃反应2h残留活性为原来的40%。活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3’→5’外切酶活性，具5’→3’外切活性。用途：

1.PCR反应。

2.测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。第72页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶五、逆转录酶（reversetranscriptase）

依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。

来源商品反转录酶有两种：来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)(42℃)。来自能表达Moloney鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的E.coli(37℃)。

结构和活性：酶类别肽链5’-3’聚合活性RNAseHAMVα62，000β94，000

++++M-MLV84，000++第73页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶五、逆转录酶（reversetranscriptase）

用途：

(1)5’→3’聚合酶活性,能以RNA或DNA模板合成DNA分子；

(2)RNA酶H活性：对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了在反转录完成后再用NaOH降解RNA模板的步骤。

(3)用于３’凹陷末端的标记，杂交探针的制备和DNA序列测定。第74页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第三节

DNA聚合酶和反转录酶五、逆转录酶（reversetranscriptase）

RNaseH活性第75页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第四节DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶来源及特点：

简称末端转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’→3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。

它不需要模板，可以用含有的3’-OHDNA片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA，也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA。用途：

1.催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。

2.催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：

生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。

3.用于在平头DNA上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。第76页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第四节DNA修饰酶第77页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院末端转移酶功能图解第四节DNA修饰酶3‘突出末端第78页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院二、T4噬菌体多核苷酸激酶来源从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。功能

催化

磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。

不论5’-OH端突出与否。

用途：DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸激酶第四节DNA修饰酶第79页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院三、碱性磷酸酶

1）碱性磷酸酶种类

细菌性碱性磷酸酶（Bacterialalkalinephosphatase，BAP），从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。

小牛肠碱性磷酸酶（Calfintestinalalkalinephosphatase，CIAP），从小牛肠中纯化出来。加热68℃可完全失活。

2）碱性磷酸酶的特性

催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。

3’HO-

-P

5’

3’HO-

-OH

5’3’HO-

-OH

碱性磷酸酶

5’P-

-OH

3’5’

第四节DNA修饰酶第80页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第四节DNA修饰酶第81页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院3)碱性磷酸酶的功能

防止线性化的载体份子自我连接

其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。第四节DNA修饰酶第82页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第五节

外切酶核酸（自学）

核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。一、作用于单链的核酸外切酶

如：大肠杆菌核酸外切酶I（exoI）；大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）二、作用于双链的核酸外切酶

如：大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）；

噬菌体核酸外切酶（

exo）；T7噬菌体基因6核酸外切酶三、既可作用于单链又可作用于双链的核酸外切酶

如：Bal31核酸酶

第83页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院DNA外切酶切割方式识别位点单链大肠杆菌核酸外切酶I（exoI）5’

3’5’-OH大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’

3’3’

5’5’-P3’-OH双链核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）3’

5’3’-OH

噬菌体核酸外切酶（

exo）5’

3’5’-PT7噬菌体基因6核酸外切酶5’

3’5’-P5’-OH单、双链Bal31核酸酶5’

3’3’

5’3’-OH不同核酸外切酶的特性比较第五节

外切酶核酸第84页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第五节

外切酶核酸第85页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第六节

单链内切核酸酶

一、S1核酸酶

来源：来源于稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）

功能：是一种高度单链特异的核酸内切酶。注意：

对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。

酶量大可完全消化双链，中量，可在切口或小缺口处切割双链

用途：

(1)测定核酸分子的杂交程度；

(2)去除DNA片段中突出的单链尾巴；

(3)打开cDNA合成时形成的发夹环结构。第86页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院一、S1核酸酶第六节

单链内切核酸酶第87页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院一、S1核酸酶第六节

单链内切核酸酶第88页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院一、S1核酸酶第六节

单链内切核酸酶第89页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第六节

单链内切核酸酶一、S1核酸酶S1的用途：合成CDNA时切除单链环第90页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院二、脱氧核糖核酸酶I来源于牛胰脏，分子质量为31ku，是一种糖蛋白。用途：

1.与大肠杆菌DNA聚合酶I一起参加切口平移

2.制作DNA文库

3.使用DNaseI足迹法测定DNA结合蛋白在DNA上的精确结合位点

4.去除转录产物中的模板DNA第六节

单链内切核酸酶第91页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院第七节

RNA酶一、核糖核酸酶A来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶。可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3‘端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。反应终产物是嘧啶3’磷酸及末端带嘧啶3‘磷酸的寡核苷酸。用途：（1）从DNA-RNA或RNA-RNA杂合体中去除未杂合的RNA区（2）确定DNA或RNA中单碱基突变的位置（3）RNA检测（4）降解DNA制备物中的RNA分子第92页，课件共97页，创作于2023年2月生命科学学院

二、核糖核酸酶H核糖核酸酶H(RNaseH)催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的核内降解，产生不同链长带3‘羟基和5’磷酸末端的寡核糖核酸。第七节

RNA酶